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Patatin是一种马铃薯糖蛋白,因其优越的溶解性、起泡性、乳化性、抗氧化性和抗癌等蛋白特性以及不同于一般贮藏蛋白的酯酰基水解酶活性,具备广阔的应用潜能,且随着我国马铃薯主食化的快速发展,使其在食品领域备受关注。但它在天然马铃薯中含量较低,提取纯化方法复杂且制备成本高,使其酶学特性没有得到充分的研究,这也制约了其在食品、医药等行业的广泛应用,因此它的制备方法、酶学性质有待于进一步研究。目前通过真核、原核表达系统进行外源蛋白表达的技术已经十分成熟,已通过此方法制备出大量性质优良,利用率高的酯酶。因此本研究拟利用马铃薯源酯酶基因patatin分别在大肠杆菌和毕赤酵母两种表达系统中进行异源表达,研究该酶的表达系统构建和表达条件,之后进行酶学性质的系统探究,研究其对于天然底物的作用效果,对其分解产物进行初步探索,以期为其在食品、医药等领域的利用开辟新道路。主要研究结果如下:1.Patatin基因的生物信息学分析。利用生物信息学分析工具,对Patatin基因进行同源序列比对、进化树分析和稀有密码子分析,预测其基本理化性质:该蛋白由386个氨基酸组成,相对分子质量是42.49 k Da,属于亲水性蛋白,存在信号肽、跨膜域等。2.Patatin大肠杆菌表达系统构建及表达。从马铃薯块茎中克隆基因patatin,与载体p ET-28a（+）连接构建重组质粒,转入Escherichia coli BL21（DE3）宿主中诱导表达,并确定patatin-E的最佳诱导培养条件:诱导温度为24°C、诱导时间为26 h、初始p H为7、诱导剂IPTG浓度为20μmol·L-1、接种量为10%、装液量为100 m L、转数为180 r·min-1;同时确定最佳培养基为SB培养基;确定最佳培养基外加营养组分:10 mmol·L-1葡萄糖、5 mmol·L-1酪氨酸以及10 mmol·L-1Mg Cl2,在此组分下,patatin-E总酶活力提高了6.2倍。纯化后patatin-E的比酶活力达到18.68 U·mg-1,纯化倍数为85倍,回收率达70.2%。产率:100 m L的培养基中可产29.35 U的纯酶。3.Patatin毕赤酵母表达系统构建及表达。将目的基因与载体p GAPZαA连接构建重组质粒,转入Pichia pastoris X-33宿主中分泌表达,并确定patatin-P的最佳培养条件:培养温度为28°C、培养时间为144 h、初始p H为8、接种量为2.0%、装液量为100 m L;同时确定最佳培养基外加营养组分:50 mmol·L-1蔗糖、50 mmol·L-1酪氨酸以及10 mmol·L-1Mg Cl2,在此组分下,patatin-P的酶活力提高了2.2倍。纯化后patatin的比酶活力达到1.63U·mg-1,纯化倍数为8倍,回收率达85.7%。产率:100 m L的培养基中可产219.91U的纯酶。4.Patatin酶学性质分析及对天然油脂分解作用初探本章对两种表达系统制备的patatin的酶学性质进行探究。首先,最适反应条件。patatin-E与patatin-P的最适反应温度均为37°C,最适p H均为9,patatin-E的反应时间为25 min,patatin-P的反应时间30 min;其次,蛋白的稳定性。二者在30-90°C的温度范围及6.0-9.0的p H的范围内均较为稳定,残余相对酶活力仍高达60%以上;在常温放置28天酶活力仅下降30%左右,所以贮藏稳定性较好;Al3+、Mg2+和Fe2+对酶活有显著促进作用,Ni2+、Fe3+对蛋白活性抑制效果最明显;除乙酸乙酯和氯仿外,大部分有机溶剂对酶活影响不显著,该酶有较好的有机溶剂耐受性;EDTA、SDS、β-巯基乙醇和DTT对酶活性有抑制效果,对patatin-E的活性抑制效果更为明显;最后,底物特异性。二者对短链底物（p-NPC2和p-NPC4）水解能力均较强,对长链底物(p-NPC12和p-NPC16)仍有一定的水解活性,二者均与p-NPC2的亲和力最高,Vmax分别为49.75 mmol·L-1·min-1和50.00 mmol·L-1·min-1,Km分别为1.01 mmol·L-1和1.14 mmol·L-1;该酶具有广泛的底物特异性且对于富含饱和脂肪酸的天然油脂水解活性更高。对比发现,二者的稳定性较好,patatin-E的贮藏稳定性更好,而patatin-P对于化学试剂的耐受性更强。综上所述,patatin基因在大肠杆菌系统中胞内表达,诱导培养26 h,在毕赤酵母系统中则为分泌表达,培养需要144 h;patatin-E比patatin-P的比酶活和纯化倍数高,但后者的纯化回收率更高且产率是patatin-E的7.5倍。研究结果有助于降低发酵成本、大量获得高生物活性且稳定的patatin,这将有利于实现它的工业化生产;同时对其酶学性质的充分研究,并且发现patatin既具备酯酶又具有脂肪酶的双功能活性,可使其在食品、医药等领域得到更广泛的应用。