番茄青枯病是一类危害严重的世界性土传细菌病害,它的有效防治已经成为番茄生产中亟待解决的难题。本研究从生物防治的角度出发,分离筛选了对番茄青枯病有拮抗作用的菌株,通过温室盆栽试验和田间小区试验进行了防治效果和田间应用效果评价。旨在为高效芽孢杆菌的研制和使用提供理论依据和技术支持。 主要研究内容有以下几个方面: 1.从山东寿光和苍山不同种植年限的蔬菜大棚中分离得到的45株菌株以及中国农业微生物菌库中保存的19株菌株中,利用点接法筛选到14株对茄科劳尔氏菌有拮抗作用的菌株,然后通过牛津杯法复筛得到6株抑菌效果较好的菌株。通过温室盆栽试验表明拮抗菌X10的防治效果最好,液体菌剂防治效果达到了81.8%,固体菌剂防治效果达到了65.4%。 2.对番茄青枯病拮抗菌X10进行了形态学特征、生理生化特征测定,结果表明它与侧孢短芽孢杆菌种的特征一致。测定了菌株的16S rDNA序列并根据其构建了系统发育树,在系统发育树中,X10与侧孢短芽孢杆菌形成一个类群,序列同源性为99%。因此将X10鉴定为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)。 3.从侧孢短芽孢杆菌X10发酵液中提取的拮抗蛋白粗提液具有抑制茄科劳尔氏菌生长的效果,该抗菌蛋白粗提液具有良好的热稳定性,能耐90℃的高温;用蛋白酶处理,其抑菌活性受胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K的影响;对氯仿敏感;随着紫外照射时间的延长,活性受到影响;拮抗物质25℃保存,活性28d内基本不变;作用活性pH(pH 5.0～11.0)范围较宽,这对于芽孢杆菌用于生物肥料的生产和保藏具有一定的理论指导作用。 4.根据温室盆栽试验的结果,制备侧孢短芽孢杆菌X10的固体菌剂,在山东莱阳赵旺庄乡露地蔬菜栽培区和山东肥城科技示范园的蔬菜大棚里进行了小区试验,对田间应用效果进行了测定。结果表明固体菌剂的两种接种量对番茄青枯病的防治效果分别达到了58.42%和68.68%,固体菌剂蔬菜大棚施用能够促进番茄植株生长和增加产量。 5.提取了侧孢短芽孢杆菌X10的基因组DNA,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,以启动子探针pUC19-GFP为载体,通过鸟枪法在大肠杆菌DH5a中构建了X10的启动子文库。通过筛选获得了14个阳性克隆,编号为P1～P14。对P2、P3、P6、P9、P10、P13和P14克隆中的重组质粒的插入片段进行了测序和在线启动子预测。结果显示插入片段Ps3和Ps6具有典型的原核启动子的特征,其它五个插入片段则没有典型的原核启动子特征。将Ps6插入到穿梭载体pNW33N的多克隆位点,构建了含侧孢短芽孢杆菌X10自身启动子和GFP的质粒载体,为监测侧孢短芽孢杆菌X10在番茄根际的定殖提供了有利的工具。