论文部分内容阅读
目的:HPV16持续性感染常与肺癌的发生密切相关,E6和E7蛋白是肺癌发生发展的主要致癌基因。我们前期研究发现,HPV16 E6和E7蛋白均可上调HIF-1α蛋白的表达,进而上调肺癌细胞中GLUT1蛋白和mRNA的表达。然而,HPV16中的E6和E7蛋白调控HIF-1α表达的分子机制并不清楚。Chlon等人发现E6蛋白主要通过降解p53基因抑制细胞凋亡。Todorovic等人发现E7蛋白主要通过抑制视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)促进细胞增殖。据报道,RRAD是p53的直接靶基因。因此,我们推测E6蛋白可通过降解p53下调RRAD的表达,但E7蛋白是否可调控RRAD的表达目前尚不清楚。RRAD是Ras相关小GTase家族的一个成员,在一些Ⅱ型糖尿病患者中此基因过表达。RRAD蛋白在肿瘤细胞中低表达,并且与肿瘤的进展及不良预后密切相关。Zhang C等研究证明在肺癌细胞中抑癌基因RRAD抑制肿瘤细胞瓦博格效应。Liu J等提出RRAD可负性调控NF-κB的激活。然而,RRAD在HPV相关性肺癌中的分子机制尚不清楚。因此,深入的了解HPV相关性肺癌中RRAD的调控机制,可为肿瘤研究相关领域包括肿瘤标志物及肿瘤的靶向治疗等方面提供新的研究方向。研究方法:首先我们应用转染及干扰技术双向调控肺癌细胞中HPV16 E6和E7的表达,应用蛋白免疫印迹(Western blotting)和实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)实验分别检测RRAD、p65、HIF-1α、GLUT1蛋白和mRNA的表达水平,p-p65蛋白的表达水平;然后采用干扰技术调控肺癌细胞中RRAD的表达,应用蛋白免疫印迹(Western blotting)和实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)实验分别检测p65、HIF-1α、GLUT1蛋白和mRNA的表达水平,p-p65蛋白的表达水平;采用干扰技术调控肺癌细胞中p65的表达,应用蛋白免疫印迹(Western blotting)和实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)实验分别检测了HIF-1α和GLUT1蛋白和mRNA的表达水平;采用干扰技术调控肺癌细胞中RRAD的表达,应用免疫荧光实验检测p65蛋白核浆分布的情况;采用干扰技术调控肺癌细胞中RRAD的表达,应用核浆分离技术分离细胞核蛋白与细胞浆蛋白,再应用蛋白免疫印迹(Western blotting)检测细胞核及细胞浆内p65、p-p65蛋白表达情况;应用SPSS22.0统计分析软件处理分析实验数据,以P<0.05表示具有显著性差异。结果:1.肺癌细胞系的筛选。首先根据我们前期的实验结果,HPV16 E6和E7蛋白在NCI-H460细胞系中表达较低,在A549和LK2细胞中表达较高。因此,我们选择NCI-H460细胞系转染了pEGFP-N1-HPV16 E6和pEGFP-N1-HPV16 E7质粒,而在A549和LK2两种细胞系中转染SiE6和SiE7干扰其内源E6和E7的表达。其次我们在4种肺癌细胞系(NCI-H460、H1299、A549、LK2)中应用蛋白免疫印迹实验分别检测了RRAD、p65蛋白的表达情况。我们发现RRAD蛋白在肺癌细胞系NCI-H460中表达较高,p65蛋白在肺癌细胞系A549和LK2中表达较高。基于此结果,我们选择NCI-H460细胞系应用SiRNA干扰其内源RRAD的表达,A549及LK2两种细胞系应用Si RNA干扰其内源p65的表达。2.E6和E7下调RRAD的表达,上调p65、p-p65、HIF-1α和GLUT1的表达。我们将pEGFP-N1-E6和pEGFP-N1-E7瞬时转入低表达E6和E7的NCI-H460中,以E6或E7空载体和模拟转染为对照。结果表明,过表达E6和E7显著下调了RRAD蛋白和mRNA的表达,但同时上调了GLUT1蛋白和mRNA的表达。过表达E6和E7也上调了p65、p-p65和HIF-1α蛋白的表达。3.敲除E6和E7上调RRAD的表达,下调p65、p-p65、HIF-1α和GLUT1的表达。为了进一步验证E6和E7对RRAD、p65、p-p65、HIF-1α和GLUT1的调控作用,我们应用E6或E7特异性SiRNA敲除A549和LK2细胞系中E6或E7的表达,以E6或E7非特异性Si RNA和模拟特异性SiRNA为对照。结果表明,敲除E6和E7均上调了RRAD蛋白和mRNA的表达,但同时下调了GLUT1蛋白和mRNA的表达。敲除E6和E7也下调了p65、p-p65和HIF-1α蛋白的表达。4.敲除RRAD上调p65、p-p65、HIF-1α和GLUT1的表达。选择高表达RRAD的细胞系NCI-H460,应用RRAD特异性SiRNA敲除RRAD的表达,以RRAD非特异性SiRNA和模拟特异性SiRNA为对照。结果表明,敲除RRAD明显上调了p65和p-p65蛋白的表达,同时上调了HIF-1α和GLUT1蛋白和mRNA的表达。RRAD非特异性SiRNA和模拟特异性SiRNA的表达变化很小或没有变化。5.敲除p65下调HIF-1α和GLUT1的表达。应用p65特异性SiRNA抑制A549和LK2细胞系中p65的表达,以p65非特异性SiRNA和模拟特异性SiRNA为对照。结果表明,敲除p65明显下调了HIF-1α和GLUT1蛋白和mRNA的表达。p65非特异性SiRNA和模拟特异性SiRNA的变化很小或没有变化。6.敲除RRAD促进p65核转位。为了进一步验证RRAD对p65定位的调节作用,我们敲除NCI-H460细胞中RRAD的表达,应用免疫荧光实验检测p65在细胞内的定位情况。结果表明,敲除RRAD明显促进p65核转位。7.敲除RRAD上调细胞核中p65和p-p65的表达,下调细胞浆中p65的表达。我们敲除NCI-H460细胞中RRAD的表达,以RRAD非特异性SiRNA和模拟特异性SiRNA为对照。应用核浆分离技术分离细胞浆蛋白和细胞核蛋白。Western blotting实验结果显示,敲除RRAD上调细胞核中p65和p-p65的表达,而下调细胞浆中p65的表达。细胞浆中p-p65的表达水平几乎没有变化。结论:1.HPV16中的E6和E7蛋白均可下调RRAD蛋白和mRNA的表达。本实验首次发现过表达E7蛋白也可下调RRAD蛋白和mRNA的表达,然而两者的调控机制可能不同;2.NF-κB的转录活性有两种理论报道,一种是p65的核转位,另一种是p-p65的表达。本研究发现,抑癌基因RRAD负性调控NF-κB的转录活性是由p65核转位和细胞核中p-p65表达水平两个因素决定的,两者缺一不可;3.敲除NF-κB中亚单位p65后,明显下调HIF-1α蛋白和mRNA的表达,进而下调GLUT1蛋白和m RNA的表达。p65对HIF-1α的调控结果与E6和E7蛋白对HIF-1α的调控结果并不完全一致,可能与调控机制不完全一致相关。