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目的:
本研究运用LC-MS导向分离技术，提取分离木豆叶中茋类单体化合物，得到系列茋类化合物1-5;选取临床分离的标准株MRSA JCSC4744，首次展开系列茋类化合物体内、外抗菌活性和抗菌机制初步研究，致力于寻找具有抗MRSA活性的先导化合物。
方法:
1.茋类化合物的富集与单体的分离。木豆叶阴干称重20kg，粉碎，用95％工业酒精室温浸泡3次，每次7天，合并提取液，减压浓缩至无乙醇味，得到总浸膏(3.53kg)。浸膏用水悬浮，乙酸乙酯萃取，减压浓缩萃取液，得到乙酸乙酯部位(1.34kg)。根据文献报道，木豆叶中茋类化合物的分子量基本在250-350范围内，随后对获得的乙酸乙酯部位进行LC-MS分析，同时结合茋类化合物结构的强紫外吸收的特点，筛选出茋类化合物富集的部位，并根据茋类化合物富集部位在HPLC中的保留时间，选用合适的柱层析手段，对其进一步富集和分离纯化，获得单体化合物。对分离获得的化合物，通过1H、13C、DEPT等1D NMR数据，结合质谱等理化常数，确定化合物的结构。
2.测定茋类单体化合物卜5的最小抑菌浓度(MIC，minimal inhibitory concentration)和最小杀菌浓度(MBC，minimum bactericidal concentration)。采用微量稀释法，使96孔板中第1孔至第10孔药物浓度依次为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.12μg/mL、1.56μg/mL、0.78μg/mL、0.39μg/mL、0μg/mL。将100μL含有106CFU/mL的测试菌和刃天青显色剂(0.06mg/mL)的MH培养基加入各孔中，孵育12h。设置阳性对照万古霉素(Van，vancomycin)组，每种抗菌药物做3个复孔。MIC定义为保持蓝色的最低抗生素浓度。
3.茋类化合物1-5对标准菌株MRSA JCSC4744动态杀菌曲线。以木豆素A(LLA)为例，取稀释至1×106CFU/mL的MRSA菌液1.8mL于24孔板，分别加入7.8μg/mL万古霉素、62.5μg/mL万古霉素、15.6μg/mL木豆素A、125μg/mL木豆素A各0.2mL，则分别得到0.78μg/mL(1×MIC)万古霉素、6.25μg/mL(8×MIC)万古霉素、1.56μg/mL(1×MIC)木豆素A、12.5μg/mL(8×MIC)木豆素A处理液。将24孔板置于37℃恒温箱孵育，分别在孵育的第0h、O.5h、2h、4h、8h、24h测定各组细菌数量;培养时间为横坐标，细菌数量的对数为纵坐标，绘制木豆素A杀菌曲线，分析其动态杀菌效应。同样的方法测定化合物2-5杀菌曲线。
4.木豆素A体内抗MRSA实验。将6-8周龄SPF级雌性Balb/c小鼠随机分为空白组、MRSA模型组、MRSA+Van组、MRSA+LLA组，每组12只。小鼠剃毛后，在背部开达筋膜的创口(直径1cm)。除空白对照组外，每个小鼠伤口部位接种菌造模，并在对应组别涂覆PBS、0.2mg/mL万古霉素药物和0.2mg/mL木豆素A各50μL。每两天计录每只小鼠的体重、伤口大小，直至小鼠伤口愈合;感染MRSA第3天，每组随机抽取小鼠，测伤口细菌数量、血清中肿瘤坏死因子(TNF-α，tumour necrosis factor-alpha)、白介素6(IL-6，interleukin-6)含量，对其伤口皮肤组织进行革兰氏染色(Gram)、吉姆萨染色(Giemsa)、免疫组化(IHC，immunohistochemistry)染色实验，分析木豆素A体内抗菌活性。
5.茋类化合物1-5抗MRSA机制初步探讨。使用“细胞膜极性分析法”分析化合物是否通过破坏MRSA菌株的细胞壁来达到抗菌作用;取对数生长期的MRSA JCSC4744标准株，用缓冲溶液(pH=7.0的5mM HEPES)洗涤，重:悬获得OD600=0.1的细菌悬液，后加入0.4μM染色剂3，3-dipropylthiacarbocyanille(DiSC3-5)，37℃黑暗处理20min，再分别加入系列浓度的1-5(0.5×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC)或等体积的DMSO，并在激发波长为660nm和发射波长为675nm的情况下监测荧光的变化;使用“SYTOX Green吸收分析法”分析化合物是否通过破坏MRSA菌株的细胞膜来达到抗菌作用。
结果:
1.在LC-MS导向分离技术支持下，从木豆叶乙酸乙酯部位快速获得5个茋类化合物，经核磁数据与文献对比，鉴定其结构为:木豆素A(longistyline A)(1)、木豆素(caianine)(2)、木豆素C(longistyline C)(3)、2-羟基-4-甲氧基-3-异戊烯基-6-苯乙基苯甲酸(2-hydroxy-4-methoxy-3-isopentenyl-6-phellethylbenzoic acid)(4)、3-甲氧基-5-羟基-2-(3-甲基-2-丁烯基联苄)(3-methoxy-5-hydroxy-2-(3-methyl-2-butenylbibenzyl))(5)。
2.MIC与MBC实验结果表明对耐药菌株MRSA(JCSC4744、JCSC4469)菌株，1的MIC、MBC均为1.56μg/mL;2的MIC、MBC均为6.25μg/mL;3的MIC、MBC均为12.5pg/mL;4的MIC为3.12-6.25μg/mL、MBC为3.12-6.25μg/mL5的MIC为50μg/mL;Van的MIC为0.78μg/mL、MBC为1.56μg/mL。对金黄色葡萄球菌(S.aureus，Staphylococcus aureus)，茋类化合物1-5也显示良好的杀菌活性;对于蜡样芽胞杆菌(B.cereus，Bacillus cereus)，茋类化合物1-4相较于万古霉素的MIC、MBC值较小;茋类化合物1-5对大肠杆菌(E.coil，Escherichia coli)未显示明显得抗菌活性。
3.Time-killing杀菌实验，选择MRSA JCSC4744进行实验研究。结果显示，浓度为8×MIC的化合物1-5处理组，前0.5h内细菌数量迅速降低，显示化合物1-5快速的杀菌功效:浓度为1×MIC的1-5处理组，8h后，MRSA存活率迅速降低3×log(降低了99.9％)，而Van需要24h才能达到相同的杀菌效果。
4.感染MRSA第3天，LLA和Van处理的感染小鼠显示出伤口愈合趋势，与此相反的是MRSA模型组感染小鼠的切除区域出现明显化脓现象，且所有小鼠在5天内全部死亡。到第7天，除模型组外的其他组小鼠伤口均可见结痂现象，空白对照组显示出最佳的伤口愈合功效，其次是LLA组;此外，LLA和Van组与对照组几乎有相同伤口治愈时间，且均缓解了感染MRSA引起的体重减轻现象。皮肤组织细菌计数实验中可以看出，LLA、Van处理后细菌数量极显降低(P＜0.01)，这也与革兰氏染色实验结果一致，革兰氏染色结果显示，Van和LLA处理的感染小鼠显示微弱的阳性反应;与Van组相比，LLA组降低MRSA细菌数量更显著(P＜0.05)。吉姆萨染色、免疫组化染色以及炎症因子TNF-α、IL-6检测实验均表明用LLA处理后显著降低小鼠免疫反应:模型组血清IL-6为606.57士68.99pg/mL，TNF-α为280.58士42.27pg/mL，经LLA治疗后，两种炎症细胞因子降低至180.74士10.78pg/mL，87.25士10.19pg/mL，显著降低小鼠免疫反应(P＜0.05，P＜0.01)。
5.细胞质膜去极化分析研究中，与DMSO空白组比较，在浓度为0.5×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC的茋类化合物1-5处理后，荧光信号的显着增加，且荧光信号与时间、剂量呈正相关;SYTOX green实验结果显示，SYTOX green核酸染料与MRSA和浓度为O.5×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC茋类化合物1-5处理4h后，荧光强度增加，且存在明显的量效关系;SEM实验中，8×MIC化合物1-5处理MRSA细胞4h后，观察到MRSA细胞有不同程度的裂解，膜上有囊泡等现象。
结论:
1.木豆叶中含有多种茋类化合物且其含量丰富。
2.茋类化合物1-5对MRSA显示不同程度的抗菌活性，其中LLA对MRSA JCSC4744的MIC为1.56μg/mL，表现出较强抗菌活性。
3.Time-killing实验表明茋类化合物1-5在1×MIC、8×MIC浓度均表现高效的杀菌活性。
4.体内抗菌实验表明LLA细胞毒性较小，且能缓解感染MRSA带来的体重降低的影响，加快伤口愈合、降低死亡率、降低伤口细菌数量、降低血清中TNF-α和IL-6炎症因子，降低免疫反应。
5.茋类化合物1-5抗菌机制与细菌细胞膜电位的耗散、破坏膜的渗透性、诱导细菌裂解有关。
本研究运用LC-MS导向分离技术，提取分离木豆叶中茋类单体化合物，得到系列茋类化合物1-5;选取临床分离的标准株MRSA JCSC4744，首次展开系列茋类化合物体内、外抗菌活性和抗菌机制初步研究，致力于寻找具有抗MRSA活性的先导化合物。
方法:
1.茋类化合物的富集与单体的分离。木豆叶阴干称重20kg，粉碎，用95％工业酒精室温浸泡3次，每次7天，合并提取液，减压浓缩至无乙醇味，得到总浸膏(3.53kg)。浸膏用水悬浮，乙酸乙酯萃取，减压浓缩萃取液，得到乙酸乙酯部位(1.34kg)。根据文献报道，木豆叶中茋类化合物的分子量基本在250-350范围内，随后对获得的乙酸乙酯部位进行LC-MS分析，同时结合茋类化合物结构的强紫外吸收的特点，筛选出茋类化合物富集的部位，并根据茋类化合物富集部位在HPLC中的保留时间，选用合适的柱层析手段，对其进一步富集和分离纯化，获得单体化合物。对分离获得的化合物，通过1H、13C、DEPT等1D NMR数据，结合质谱等理化常数，确定化合物的结构。
2.测定茋类单体化合物卜5的最小抑菌浓度(MIC，minimal inhibitory concentration)和最小杀菌浓度(MBC，minimum bactericidal concentration)。采用微量稀释法，使96孔板中第1孔至第10孔药物浓度依次为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.12μg/mL、1.56μg/mL、0.78μg/mL、0.39μg/mL、0μg/mL。将100μL含有106CFU/mL的测试菌和刃天青显色剂(0.06mg/mL)的MH培养基加入各孔中，孵育12h。设置阳性对照万古霉素(Van，vancomycin)组，每种抗菌药物做3个复孔。MIC定义为保持蓝色的最低抗生素浓度。
3.茋类化合物1-5对标准菌株MRSA JCSC4744动态杀菌曲线。以木豆素A(LLA)为例，取稀释至1×106CFU/mL的MRSA菌液1.8mL于24孔板，分别加入7.8μg/mL万古霉素、62.5μg/mL万古霉素、15.6μg/mL木豆素A、125μg/mL木豆素A各0.2mL，则分别得到0.78μg/mL(1×MIC)万古霉素、6.25μg/mL(8×MIC)万古霉素、1.56μg/mL(1×MIC)木豆素A、12.5μg/mL(8×MIC)木豆素A处理液。将24孔板置于37℃恒温箱孵育，分别在孵育的第0h、O.5h、2h、4h、8h、24h测定各组细菌数量;培养时间为横坐标，细菌数量的对数为纵坐标，绘制木豆素A杀菌曲线，分析其动态杀菌效应。同样的方法测定化合物2-5杀菌曲线。
4.木豆素A体内抗MRSA实验。将6-8周龄SPF级雌性Balb/c小鼠随机分为空白组、MRSA模型组、MRSA+Van组、MRSA+LLA组，每组12只。小鼠剃毛后，在背部开达筋膜的创口(直径1cm)。除空白对照组外，每个小鼠伤口部位接种菌造模，并在对应组别涂覆PBS、0.2mg/mL万古霉素药物和0.2mg/mL木豆素A各50μL。每两天计录每只小鼠的体重、伤口大小，直至小鼠伤口愈合;感染MRSA第3天，每组随机抽取小鼠，测伤口细菌数量、血清中肿瘤坏死因子(TNF-α，tumour necrosis factor-alpha)、白介素6(IL-6，interleukin-6)含量，对其伤口皮肤组织进行革兰氏染色(Gram)、吉姆萨染色(Giemsa)、免疫组化(IHC，immunohistochemistry)染色实验，分析木豆素A体内抗菌活性。
5.茋类化合物1-5抗MRSA机制初步探讨。使用“细胞膜极性分析法”分析化合物是否通过破坏MRSA菌株的细胞壁来达到抗菌作用;取对数生长期的MRSA JCSC4744标准株，用缓冲溶液(pH=7.0的5mM HEPES)洗涤，重:悬获得OD600=0.1的细菌悬液，后加入0.4μM染色剂3，3-dipropylthiacarbocyanille(DiSC3-5)，37℃黑暗处理20min，再分别加入系列浓度的1-5(0.5×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC)或等体积的DMSO，并在激发波长为660nm和发射波长为675nm的情况下监测荧光的变化;使用“SYTOX Green吸收分析法”分析化合物是否通过破坏MRSA菌株的细胞膜来达到抗菌作用。
结果:
1.在LC-MS导向分离技术支持下，从木豆叶乙酸乙酯部位快速获得5个茋类化合物，经核磁数据与文献对比，鉴定其结构为:木豆素A(longistyline A)(1)、木豆素(caianine)(2)、木豆素C(longistyline C)(3)、2-羟基-4-甲氧基-3-异戊烯基-6-苯乙基苯甲酸(2-hydroxy-4-methoxy-3-isopentenyl-6-phellethylbenzoic acid)(4)、3-甲氧基-5-羟基-2-(3-甲基-2-丁烯基联苄)(3-methoxy-5-hydroxy-2-(3-methyl-2-butenylbibenzyl))(5)。
2.MIC与MBC实验结果表明对耐药菌株MRSA(JCSC4744、JCSC4469)菌株，1的MIC、MBC均为1.56μg/mL;2的MIC、MBC均为6.25μg/mL;3的MIC、MBC均为12.5pg/mL;4的MIC为3.12-6.25μg/mL、MBC为3.12-6.25μg/mL5的MIC为50μg/mL;Van的MIC为0.78μg/mL、MBC为1.56μg/mL。对金黄色葡萄球菌(S.aureus，Staphylococcus aureus)，茋类化合物1-5也显示良好的杀菌活性;对于蜡样芽胞杆菌(B.cereus，Bacillus cereus)，茋类化合物1-4相较于万古霉素的MIC、MBC值较小;茋类化合物1-5对大肠杆菌(E.coil，Escherichia coli)未显示明显得抗菌活性。
3.Time-killing杀菌实验，选择MRSA JCSC4744进行实验研究。结果显示，浓度为8×MIC的化合物1-5处理组，前0.5h内细菌数量迅速降低，显示化合物1-5快速的杀菌功效:浓度为1×MIC的1-5处理组，8h后，MRSA存活率迅速降低3×log(降低了99.9％)，而Van需要24h才能达到相同的杀菌效果。
4.感染MRSA第3天，LLA和Van处理的感染小鼠显示出伤口愈合趋势，与此相反的是MRSA模型组感染小鼠的切除区域出现明显化脓现象，且所有小鼠在5天内全部死亡。到第7天，除模型组外的其他组小鼠伤口均可见结痂现象，空白对照组显示出最佳的伤口愈合功效，其次是LLA组;此外，LLA和Van组与对照组几乎有相同伤口治愈时间，且均缓解了感染MRSA引起的体重减轻现象。皮肤组织细菌计数实验中可以看出，LLA、Van处理后细菌数量极显降低(P＜0.01)，这也与革兰氏染色实验结果一致，革兰氏染色结果显示，Van和LLA处理的感染小鼠显示微弱的阳性反应;与Van组相比，LLA组降低MRSA细菌数量更显著(P＜0.05)。吉姆萨染色、免疫组化染色以及炎症因子TNF-α、IL-6检测实验均表明用LLA处理后显著降低小鼠免疫反应:模型组血清IL-6为606.57士68.99pg/mL，TNF-α为280.58士42.27pg/mL，经LLA治疗后，两种炎症细胞因子降低至180.74士10.78pg/mL，87.25士10.19pg/mL，显著降低小鼠免疫反应(P＜0.05，P＜0.01)。
5.细胞质膜去极化分析研究中，与DMSO空白组比较，在浓度为0.5×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC的茋类化合物1-5处理后，荧光信号的显着增加，且荧光信号与时间、剂量呈正相关;SYTOX green实验结果显示，SYTOX green核酸染料与MRSA和浓度为O.5×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC茋类化合物1-5处理4h后，荧光强度增加，且存在明显的量效关系;SEM实验中，8×MIC化合物1-5处理MRSA细胞4h后，观察到MRSA细胞有不同程度的裂解，膜上有囊泡等现象。
结论:
1.木豆叶中含有多种茋类化合物且其含量丰富。
2.茋类化合物1-5对MRSA显示不同程度的抗菌活性，其中LLA对MRSA JCSC4744的MIC为1.56μg/mL，表现出较强抗菌活性。
3.Time-killing实验表明茋类化合物1-5在1×MIC、8×MIC浓度均表现高效的杀菌活性。
4.体内抗菌实验表明LLA细胞毒性较小，且能缓解感染MRSA带来的体重降低的影响，加快伤口愈合、降低死亡率、降低伤口细菌数量、降低血清中TNF-α和IL-6炎症因子，降低免疫反应。
5.茋类化合物1-5抗菌机制与细菌细胞膜电位的耗散、破坏膜的渗透性、诱导细菌裂解有关。