金针菇信息素信号通路注释及ste12基因功能研究

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我国是世界上认识和栽培利用食用菌最早的国家之一。我国有着丰富的金针菇(Flammulina filiformis)种质资源,是金针菇人工栽培的发源地和产量最大的国家。目前工厂化栽培食用菌的过程中,提高菌丝抵御非生物胁迫和降解基质能力能够缩短培养周期,获得更好的经济效益。MAPK级联放大信号通路广泛存在各种真核生物中,参与到细胞的分裂、分化、凋亡等多种生命过程。信息素信号通路属于MAPK级联放大信号通路的一部分,在酵母以及很多病原真菌中都对信息素信号通路中的基因功能进行了鉴定,发现该通路参与了酵母和丝状真菌的交配、生长发育、形态建成等生命活动。尤其是信息素信号通路下游的转录因子ste12基因是生长发育的关键因子,参与有性生殖和渗透胁迫调控。本研究首先对金针菇信息素信号通路相关基因进行了注释,通过表达分析选择ste12基因进行功能研究。然后,对ste12基因构建了过表达转化子,并通过农杆菌介导的遗传转化方法获得金针菇转化子菌株。最后,对转化子菌株的耐非生物胁迫能力与基质降解能力进行分析。本研究获得的主要结果:1.基于金针菇基因组和转录数据,对信息素信号通路及上下游基因进行了注释,结合基因的差异表达,终筛选到一个关键基因ste12。对基因ste12进行生物信息学分析,确定这是与其他大型真菌同源的一个基因。2.构建了基因ste12的过表达质粒ste12-oe,并成功转化到金针菇中,最终获得了4株金针菇ste12基因过表达转化子菌株。通过实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,q RT-PCR)技术检测到转化子菌株Ste12OE8、Ste12OE10、Ste12OE14、Ste12OE15中ste12基因的表达量相对于野生型菌株FL19分别上调了约195倍、25倍、80倍、110倍。3.对ste12过表达转化子菌株和野生型菌株进行了生长速度测定,发现在PDA培养基上,菌落形态和菌丝生长速度均无显著差异;在栽培料培养基上,转化子菌株出菇时间慢于野生型。4.通过对野生型和转化子菌株进行非生物胁迫试验,发现当ste12基因被过表达后,显著增强了菌丝的抗盐胁迫、耐高温、耐低温、抗氧化胁迫和耐酸能力,但耐碱能力低于野生型。5.通过对主要栽培基质降解酶酶活测定发现,三种主要的木质素降解酶:漆酶(Laccase,Lac)、木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase,Li P)和锰过氧化物酶(Manganese peroxidase,Mn P)以及半纤维素酶和羧甲基纤维素酶酶活力呈先上升后下降的趋势。三种主要的木质素降解酶和半纤维素酶过表达转化子菌株的酶活各时期均高于野生型,而羧甲基纤维素酶过表达转化子菌株的酶活各时期均低于野生型。本研究基于金针菇基因组数据,运用生物信息学方法注释了金针菇信息素信号通路。然后使用分子生物学技术对ste12基因参与金针菇抵抗非生物胁迫和基质降解的功能进行了分析。本研究结果能够为金针菇和其他食用菌的遗传育种和生产栽培提供一定的数据参考。
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