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刚地弓形虫(Toxoplasma gondii Nicolle & Manceaux,1908)是机会性致病原虫,可入侵宿主的所有有核细胞。免疫功能正常的机体感染弓形虫,绝大多数处于隐性感染状态,但免疫功能缺陷及免疫功能下降的机体,如孕妇、婴幼儿和器官移植的个体感染弓形虫后,可能导致脑炎,脑膜脑炎等多种严重的弓形虫病,甚至可导致死亡。妊娠作为一种特殊免疫耐受的状态,CD4+CD25+调节性T细胞这一特殊的T细胞亚群,在维持妊娠过程中发挥了极其重要的作用。本实验室前期研究发现,弓形虫RH株及弓形虫排泄分泌抗原(excreted-secreted antigens, ESA)能够引起孕鼠体内CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)数量下降,且调节性T细胞功能分子Foxp3在脾细胞及胎盘中表达下降。这些结果提示,弓形虫感染或弓形虫ESA导致CD4+CD25+调节性T细胞的数量减少,可能是导致流产发生的重要原因。许多研究指出,弓形虫感染所导致的不良妊娠结局与弓形虫感染母体的时间密切相关,但其中的分子机制仍不明确。在孕早期感染弓形虫,可导致流产、死胎等不良的妊娠后果,但在孕晚期感染弓形虫,一般不会导致流产的发生。那么这种现象的发生是否与调节性T细胞的功能状态有关?为了揭示两者之间的关系,在不同的孕期即孕5天(孕早期,G5)、孕10天(孕中期,G10)和孕15天(孕晚期,G15),我们将弓形虫ESA分别注射入孕鼠体内,于孕18天(G18)剖杀。结果发现,不同孕期注射弓形虫ESA,确实可以导致不同的妊娠后果。在孕早期注射弓形虫ESA,流产率接近100%,孕中期注射弓形虫ESA,流产率为56.20%,而孕晚期注射弓形虫ESA,流产率与正常对照组相比,差异并无统计学意义。这些结果提示,除了弓形虫虫体本身的增殖以外,弓形虫感染在不同孕期所导致不同的妊娠后果,与弓形虫所释放的排泄分泌抗原所致的免疫病理损害有关。同时我们观察到,弓形虫ESA作用于不同孕期的小鼠,可导致调节性T细胞比例不同程度的变化。在孕早期注射弓形虫ESA,调节性T细胞占脾细胞的比例大幅度地下降；孕中期注射弓形虫ESA,调节性T细胞占脾细胞的比例也下降,而孕晚期注射弓形虫ESA,调节性T细胞占脾细胞的比例并不降低。此外,我们检测了调节性T细胞占腹股沟淋巴结及外周血的比例。与脾细胞中调节性T细胞比例变化趋势一致,在孕早期注射弓形虫ESA,调节性T细胞在腹股沟淋巴结及外周血中比例下降最为明显。以上的结果提示,不同孕期注射弓形虫ESA,可导致全身调节性T细胞的改变,而并不局限于脾脏组织中。我们进一步检测了不同孕期小鼠注射弓形虫ESA后,其调节性T细胞功能的变化。我们通过增殖抑制试验及ELISA法,评价弓形虫ESA作用于不同孕期而导致调节性T细胞的功能变化。结果发现,孕早期和孕中期注射弓形虫ESA,调节性T细胞功能下降,表现为抑制淋巴细胞增殖的能力下降,及抑制Thl类细胞因子IFN-γ分泌的能力下降。孕早期注射弓形虫ESA,血清中IFN-γ水平达到448.3 pg/ml,而血清中IL-4水平,其差异并不具有统计学意义。而在孕晚期注射弓形虫ESA,调节性T细胞的功能则并没有下降,反而有所增强。我们的实验结果证实,不同孕期注射弓形虫ESA,对调节性T细胞的功能产生不同影响。为了进一步明确在不同孕期注射弓形虫ESA导致不同的妊娠结果与其调节性T细胞功能状态之间直接的关系,我们分离出孕早期注射弓形虫ESA而导致功能下降的调节性T细胞,将其过继转移至孕早期注射弓形虫ESA导致流产的小鼠模型体内,结果显示无法阻止流产的发生。而我们分离出孕晚期注射弓形虫ESA而导致功能增强的调节性T细胞,将其过继转移至同样的流产模型中,则可以阻止50%流产的发生,提示孕早期流产的发生确实是由于调节性T细胞功能下降所致。而且,不同的孕期注射弓形虫ESA,导致不同的妊娠结果与其调节性T细胞功能状态密切相关。鉴于孕早期及孕中期注射弓形虫ESA,导致调节性T细胞数量及功能下降,我们进一步探讨了弓形虫ESA导致调节性T细胞数量下降的机制。我们检测孕早期、孕中期及孕晚期注射弓形虫ESA后,CD4+CD25+调节性T细胞凋亡的情况。我们发现,孕早期及孕中期注射弓形虫ESA后,CD4+CD25+调节性T细胞7AAD-annexin V+比例增高,而孕晚期注射弓形虫ESA,CD4+CD25+调节性T细胞7AAD-annexin V+比例与对照组相比,其差异并没有统计学意义。这些结果提示,孕早期及孕中期CD4+CD25+调节性T细胞数量的减少与CD4+CD25+调节性T细胞发生的凋亡有关。为了进一步证实凋亡的存在,我们分选出CD4+CD25+调节性T细胞,检测其Caspase 3的1nRNA及蛋白表达水平。Caspase3作为凋亡的最终执行者,在孕早期及孕中期注射弓形虫ESA后,CD4+CD25+调节性T细胞Cleaved Caspase 3表达增高,孕晚期注射弓形虫ESA,CD4+CD25+调节性T细胞Cleaved Caspase 3表达与对照组并没有统计学意义。以上结果证实,弓形虫ESA引起的CD4+CD25+调节性T细胞数量的减少与凋亡有关。为了进一步探讨弓形虫ESA致CD4+CD25+调节性T细胞发生凋亡的机制,我们检测了Bcl-2及Bax的表达。结果发现,孕早期及孕中期注射弓形虫ESA后,CD4+CD25+调节性T细胞Bcl-2表达下降,而孕晚期注射弓形虫ESA,CD4+CD25+调节性T细胞Bcl-2的表达与对照组相比,其差异并没有统计学的意义。而各组中Bax的表达差异无统计学意义。这些结果表明,弓形虫ESA可能通过降低抗凋亡基因Bcl-2的表达而非提高Bax的表达,实现对调节性T细胞功能的影响。