【摘 要】
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[研究背景]爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）自身编码40多种不同的miRNA,但大多数EBV miRNA的作用仍然未知。EBV相关性胃癌EBVaGC表达有限数量的EBV潜在基因,包括EBV编码的小RNA（EBER）-1和-2,EBV核抗原（EBNA）-1,潜在膜蛋白2A（LMP2A）和BART miRNA。在所有与EBV相关的癌症（如NPC和GC）中,BART miRNA均以高水平表达。越来越多的证据
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[研究背景]爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）自身编码40多种不同的miRNA,但大多数EBV miRNA的作用仍然未知。EBV相关性胃癌EBVaGC表达有限数量的EBV潜在基因,包括EBV编码的小RNA（EBER）-1和-2,EBV核抗原（EBNA）-1,潜在膜蛋白2A（LMP2A）和BART miRNA。在所有与EBV相关的癌症（如NPC和GC）中,BART miRNA均以高水平表达。越来越多的证据表明,几种BART miRNA在癌的发生中起着重要作用,特定的miR-BART可以诱导潜伏期状态和裂解复制之间的过渡,例如,miR-BART20-5P通过靶向凋亡诱导因子Bcl-2相关的细胞死亡（BAD）mRNA激动剂来减少凋亡并增强GC细胞的生长;miR-BART22通过靶向N-myc下游调控基因1（NDRG1）来促进EBVaGC。但是,大多数BART miRNA在肿瘤发生中的作用仍需进一步研究。近年来报道指出,细胞分泌的囊泡外泌体参与包括跨膜信号转导、物质内吞、脂质及蛋白定向分选的多种功能,在细胞间物质和信息转导中发挥着重要作用。已经显示EBV癌蛋白LMP-1和许多miRNA通过外泌体的释放,并诱导相邻的细胞增殖,抑制凋亡和调节病毒感染等生物学行为的改变。越来越多的证据表明,外泌体介导的从EBV感染细胞中转移mRNA被认为是病毒进入上皮细胞的可能机制,但相关研究较少。因此,通过探究外泌体在EBV相关性胃癌的miR-BART1-3P传播中的作用和影响,从而进一步了解肿瘤的发生及传播。[目的]探讨外泌体在EBV相关性胃癌的miR-BART1-3P传播途径中的作用及影响[材料与方法]材料:EBV阳性的胃癌细胞株SNU719、EBV阴性的胃癌细胞株AGS、正常胃上皮细胞GES-1方法:1、通过慢病毒感染构建过表达miR-BART1-3P细胞株,将过表达miR-BART1-3P的AGS OE和EBV阳性的胃癌细胞株SNU719设置为实验组细胞,将转染空载病毒EBV阴性胃癌细胞株AGS NC和正常胃上皮细胞GES-1设置为对照组细胞。2、通过差速离心法提取、分离、纯化实验组细胞的外泌体,其次将外泌体与对照组细胞进行一定时间梯度的共培养,和将实验组细胞与对照组细胞进行一定时间梯度的共培养。3、观察的指标（1）形态学及EBER原位杂交观察细胞株差异;（2）通过免疫荧光染色法标记共培养的外泌体,并在激光共聚焦显微镜下观察EBV阴性细胞摄入外泌体;（3）通过transwell迁移、侵袭、划痕实验检测外泌体对EBV阴性细胞功能学的影响;（4）通过细胞-细胞共培养或者外泌体-细胞共培养,采用RT-PCR方法检测miR-BART1-3P及相关靶基因CXCL10、CXCL9、SST、GPER、IDO-1、PTGER3的相对定量表达。[结果]1、成功构建过表达miR-BART1-3P细胞株AGS2、成功提取、分离、纯化外泌体,并且细胞-细胞共培养与外泌体-细胞共培养方法的成功建立3、形态学上成功观察不同细胞株及其EBER表达情况4、外泌体-细胞共培养后,在激光共聚焦显微镜下成功观察到外泌体被染成绿色,并被EBV阴性细胞摄入胞浆内。5、细胞功能学实验中:CCK8增殖实验表明,随时间增长,加入外泌体的实验组细胞的OD值低于对照组细胞,P<0.05,差异具有统计学意义;细胞划痕实验表明,随时间增长,加入外泌体的实验组细胞迁移率低于对照组细胞,P<0.05,差异具有统计学意义;细胞迁移和侵袭实验表明,随时间增长,加入外泌体的transwell小室下层细胞数明显低于对照组,P<0.05,差异具有统计学意义。6、RT-PCR实验结果表明,细胞-细胞/外泌体-细胞共培养后,下层细胞的miRBART1-3P及相关基因CXCL10、CXCL9、SST、GPER、IDO-1、PTGER3的2^-ΔΔCt值高于对照组,P<0.05,差异具有统计学意义。[结论]1、在EBV阳性细胞和过表达miR-BART1-3P的胃癌细胞分泌的外泌体的影响下,EBV阴性的细胞株的增殖、侵袭和迁移能力受到抑制,提示这可能是EBV相关性胃癌预后较好的原因之一2、外泌体能被EBV阴性的细胞摄取,为外泌体中携带的miR-BART1-3P传播提供基础条件。外泌体能够携带EBV-miR-BART1-3P传递到受体细胞,并使受体细胞高表达miR-BART1-3P及其相关靶基因CXCL10、CXCL9、SST、GPER、IDO-1、PTGER3。
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