随着现代生命分析化学学科的蓬勃发展,人们对电致化学发光（ECL）分析方法中信号探针的生物兼容性和化学性质提出了越来越高的要求。电致化学发光纳米材料这一新型ECL信号探针应运而生,它们不仅具备了ECL性质,还随之呈现出良好的化学催化性质、大的比表面积、强的导电能力与优秀的生物兼容性等特性。这突破了传统ECL发光试剂的局限性,为ECL分析方法在生物医药、临床检测和环境评估等领域的应用开辟了新的方向。其中,金属纳米簇作为一种新型的超小纳米探针,与其他ECL纳米材料相比,具有生物相容性优异,化学性质稳定,易于标记等优点。然而,发展基于金属纳米簇的超灵敏生物传感仍面临以下两点挑战:（1）如何突破尺寸超小且粒径均一的金属纳米簇不易制备且合成步骤复杂的局限,寻找一种简单、快速、高产率的金属纳米簇制备方法;（2）如何跨越金属纳米簇的发光效率低于联吡啶钌、鲁米诺等传统发光试剂的障碍,设计一种高效、简便的催化途径促进其ECL发光效率。基于此,本论文主要从提高金属纳米簇的ECL发光效率出发,通过高可控的电沉积金属纳米簇制备方法及高效的共反应促进剂催化途径,制备了一系列性能优异的基于金属纳米簇的ECL信号探针,再结合多种生物相关辅助放大策略,构建ECL生物传感平台实现了疾病标志物的超灵敏检测,为金属纳米簇在生物传感和成像等方面的发展奠定了研究基础。本论文的研究工作主要分为以下几部分:1.基于银纳米簇/二氧化钛复合纳米材料作为高效的电致化学发光信号探针构建二茂铁驱动的信号转移生物分析研究共反应促进剂的引入提供了一种新的途径来提高发光试剂的发光效率,但这类新型的ECL促进途径的研究尚处于起步阶段。本工作首次将金属氧化物半导体二氧化钛纳米花（TiO₂ NFs）作为共反应促进剂。由于TiO₂ NFs的带隙相关催化性,其不仅能够富集内源性共反应试剂溶解氧,增加溶解氧在复合材料表面的局部浓度,还可以加速溶解氧的还原反应,生成具有强氧化性质的羟基自由基（OH^·）,以促进银纳米簇（Ag NCs）的ECL发光。基于TiO₂ NFs-Ag NCs复合纳米材料作为高效的ECL信号探针,进一步结合猝灭探针二茂铁和免疫反应驱动的DNA纳米机器,成功地构建了“on-off-on”信号转换模式的ECL生物传感器,并将其应用于阿兹海默症标志物β-淀粉样蛋白（Aβ）的超灵敏检测。该生物传感器的检测范围在50 fg/mL到500 ng/mL,检测限为32 fg/mL。本工作中巧妙地利用共反应促进剂打破了金属纳米簇ECL发光效率低的局限,为金属纳米簇在超灵敏生物检测中的应用开辟了新道路。2.以原位电沉积法制备的银纳米簇为信号探针构建生物传感器的研究并将其应用于中药的抗癌药效评估水热法金属纳米簇的制备过程复杂、产率低,使得其在生物传感中的应用受到了限制。本研究首次以原位电沉积法制备的银纳米簇（Ag NCs）为ECL信号探针,S₂O₈^2-为共反应试剂,Fe₃O₄-CeO₂纳米复合物为共反应促进剂的三元ECL体系构建免疫传感器,用于细胞周期蛋白D1（CCND1）的超灵敏检测。而CCND1的表达量与MCF-7人类乳腺癌细胞的增长和迁移有密切关联,本研究进一步利用Fe₃O₄-CeO₂-PtNPs纳米复合物和捕获抗体（anti-CCND1）组建的探针捕获中药苦参刺激后的癌细胞中CCND1蛋白,构建了双抗夹心型免疫传感器,实现了CCND1蛋白的定量检测,通过对比苦参刺激前后的蛋白表达情况来评估苦参对癌症的治疗效果。该策略对CCND1的检测范围为50fg/mL到50 ng/mL,检测限为28 fg/mL。该工作构建了一个新颖、便捷、高效的药效评估平台,对祖国医药学遗产的继承与发展具有重要的理论与实用意义。3.基于金纳米簇的三元电致化学发光纳米探针构建生物传感器用于癌症标志物的超灵敏检测目前已报道的金属纳米簇的发光效率低于传统的发光试剂,因此各方研究都在致力于寻找一种高效、简便的催化方式促进其发光。本研究以化学键交联的方式制备了牛血清白蛋白（BSA）为模板合成的金纳米簇（Au NCs）为发光物质,三-（3-氨基乙基）胺（TAEA）为共反应试剂,钯纳米粒子修饰的氧化铜纳米材料（Pd@CuO）为共反应促进剂的三元一体Au NCs-TAEA-Pd@CuO纳米材料。将三元纳米材料结合上癌胚抗体作为捕获探针,再通过免疫夹心的模式将癌胚抗原（CEA）固载在电沉积铂修饰的传感界面上构建免疫传感器。由于分子内共反应试剂和分子内共反应促进剂的双重催化,该传感器对CEA的检测范围为100 fg/mL到100 ng/mL,检测限低至16 fg/mL。综上所述,该工作展示了三元ECL纳米材料对超灵敏度生物传感及生物分析的重要意义,同时为多重自催化ECL纳米材料的设计奠定了研究基础及实践基础。4.基于DNA纳米起重机调节铜纳米簇的可控生长构建电致化学发光生物传感器用于microRNA检测的研究如何降低金属纳米簇团聚而引起的自猝灭现象,对于其ECL研究具有重要意义。鉴于此,本研究设计了一个结合功能化操纵器和尺寸固定基底的类起重机DNA纳米机器来调节铜纳米簇（Cu NCs）的发光效率,以获得高效的ECL响应,进一步Cu NCs为信号探针构建生物传感器实现microRNA-155的灵敏检测。具体构建过程如下:通过结合邻位触及DNA自组装操纵器和尺寸固定的四面体DNA纳米基底（TDN）组建DNA纳米起重机。当少量的目标物（miRNA-155）存在时,分离的DNA组件被组装,纳米起重机开始运作,使得富含AT碱基的DNA双链（dsDNA）在TDN的顶部聚合生长。随着铜离子络合在富含AT碱基的dsDNA上,每个dsDNA模板化的Cu NCs探针可以被原位电生成在单个的TDN顶端。因此,Cu NCs的粒径大小由dsDNA的AT碱基数调节,而探针之间的侧面距离被TDN的尺寸调节,这两个关键因素都将显著地影响Cu NCs的发光效率。Cu NCs通过双向调节获得了显著的ECL响应,同时超灵敏生物传感器对miRNA-155的检测限低至36 amol/L。本研究巧妙地利用DNA纳米技术来详细探讨了金属纳米簇的ECL发光机理,发掘了以金属纳米簇为基础构建的生物标记、生物传感、生物成像以及靶向肿瘤治疗平台的应用潜力。5.基于金纳米簇的协同阴、阳极电致化学发光构建简易型生物传感器用于双目标物的单界面、同时检测的研究ECL作为一种可控、灵敏的分析方法为疾病标志物的高通量灵敏检测提供了可行性平台。由于双ECL信号物质之间会产生交叉反应,使得基于双ECL信号物质构建的双目标物检测出现了不可避免的原理性误差。本工作采用了Au NCs作为单一的ECL信号物质,通过阴极和阳极的共反应促进剂ECL催化路径,同时激发Au NCs的双极ECL发光。为了达到双组分灵敏检测的要求,二氧化钛纳米片（TiO₂ NSs）为阴极共反应促进剂催化共反应试剂溶解氧的还原从而促进Au NCs在-1.5到0.0 V产生阴极ECL响应,同时氧化亚铜@铜纳米粒子（Cu₂O@Cu NPs）为阳极共反应促进剂加速共反应试剂N,N-二甲基乙二胺（DEDA）的氧化从而促进Au NCs在0.0到1.2 V产生阳极ECL响应。因此,阴极ECL探针（Au NCs-TiO₂ NSs/O₂）和阳极ECL探针（Au NCs-Cu₂O@Cu NPs-DEDA）之间有约为2.7 V的显著峰值电位差,为单界面上实现电压分辨双目标物检测奠定了坚实的基础。借由Au NCs阴阳极的显著ECL响应同时实现癌胚抗原（CEA）和黏蛋白1（MUC1）的灵敏、准确检测,其检测限分别为0.43 pg/mL及5.8 fg/mL。本研究巧妙地利用金属纳米簇的双极ECL响应的特性解决了ECL双组分同时检测的难题,为贵金属纳米簇在高灵敏、高通量生物传感器的发展开辟了新方向。