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犬瘟热(Canine Distemper,CD)是由犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus,CDV)引起的急性、高度接触性传染病。犬瘟热对我国的养殖业(如养犬业、毛皮动物养殖业及其它经济类养殖动物等)以及自然界生态系统的稳定(如危害野生保护动物)造成了严重的威胁,并带来不可估量的损失。目前,我国市场广泛使用的犬瘟热疫苗主要针对犬,仅有两种疫苗针对毛皮动物(水貂和狐狸)。疫苗可以有效的控制犬的犬瘟热,但是针对濒危物种(如东北虎、华南虎、小熊猫等),其安全性和免疫效果仍有很大争议。近些年新兴的基因工程疫苗,不但具有灭活疫苗或者亚单位疫苗的安全性,而且还具有弱毒疫苗能诱导细胞免疫应答的特点。因此,为犬瘟热疫苗的研究提供了新的思路,指出了新的方向。本试验主要对分离到的东北虎源和小熊猫源犬瘟热病毒的H基因和F基因全长序列进行测序,并从核苷酸水平,氨基酸水平及蛋白水平对分离得到的犬瘟热病毒F基因和H基因序列进行分析比较。将虎源犬瘟热病毒的H基因和F基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA-F和pcDNA-H,并初步分析重组质粒的免疫原性。序列测定结果分析:4株犬瘟热病毒的H基因全长1824 bp,编码607个氨基酸,含有9个潜在的N-联糖基化位点,而且具有549Y的特点。同源性分析表明:与大熊猫源毒株(AF178038)和虎源毒株(KM386683)有高度的核苷酸相似性(99%)。与标准毒株A75/17相比,同源性为96.5%~96.9%,与传统疫苗株(Onderstepoort株和Recombinant Snyder Hill株)相比,同源性分别为92.2%~92.6%和91.9%~92.3%。4株犬瘟热病毒的F基因全长1989 bp,编码663个氨基酸。同源性分析表明:与犬源毒株(GZ0803,KC667066)、犬源毒株(GZ0804,KC667068)、狐狸源毒株[HeB(07)1,EU327874]、浣熊源毒株[HeB(07)2,KP064126]和水貂源毒株(KC427278)有高度的核苷酸相似性(99%)。与标准毒株A75/17相比,同源性为93.9%,与Onderstepoort疫苗株相比,同源性为90.4%~90.5%,与传统疫苗株CDV3相比为90.4%~90.6%。以分离的虎源犬瘟热病毒为研究对象,分别针对F基因和H基因,设计了两对特异性克隆引物,分别在上游引物的5’端和下游引物的3’端插入酶切位点XhoⅠ和XbaⅠ,并且在上游引物起始密码子ATG后加入FLAG标签序列。用内切酶XhoⅠ和XbaⅠ双酶切扩增得到的目的片段和真核表达载体pcDNA3.1(+),后经T4 DNA连接酶作用后得到重组表达质粒pcDNA-F和pcDNA-H。本试验采用体内试验和体外试验共同验证pcDNA-F和pcDNA-H的免疫原性。体外试验采用脂质体介导法分别将pcDNA-F和pcDNA-H真核表达质粒转染BHK-21细胞,采用间接免疫荧光法和蛋白免疫印迹法检测重组质粒在体外细胞的表达情况;体内试验则是通过肌肉免疫BALB/c小鼠,分别对免疫前和四次免疫后的小鼠血清抗体检测,分析重组质粒在体内的表达情况。结果表明,真核表达载体pcDNA-F和pcDNA-H被成功构建,且均具有免疫原性,但诱导抗体效价有待进一步提高。