论文部分内容阅读
第一部分:CYP1B1在结直肠癌中的临床意义目的:探讨CYP1B1在结直肠癌中的临床意义方法:选择231例在江南大学附属医院确诊,并在该院接受结直肠癌根治术的患者的术后病理组织构建组织芯片。免疫组织化学法检测CYP1B1在肿瘤组织及毗邻癌旁正常组织中的表达,通过约登指数确定CYP1B1高低表达的截断值,分析CYP1B1的表达与临床病理参数之间的关系。采用Kaplan-Meier法进行生存分析并绘制生存曲线,采用Cox 比例风险回归模型进行预后多因素分析。结果:免疫组化结果显示,CYP1B1阳性染色主要表达在结直肠癌细胞质。与毗邻癌旁正常组织相比,CYP1B1在结直肠癌组织中的表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。根据约登指数,确定CYP1B1高低表达的免疫组化评分截断值为4.75,以此值为界线,有92例患者为CYP1B1高表达,其表达仅与性别相关,男性患者中CYP1B1高表达者较多,差异有统计学意义(P<0.05)。生存分析显示:CYP1B1是结直肠癌的不良预后因素,CYP1B1高表达患者的预后显著较差,差异有统计学意义(P<0.01),多因素Cox回归分析显示CYP1B1的表达是结直肠癌独立的不良预后因素之一,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:CYP1B1是结直肠癌的不良预后因素,CYP1B1高表达的结直肠癌患者预后较差。CYP1B1是结直肠癌独立的不良预后因素之一。第二部分:CYP1B1在结直肠癌中的生物学功能研究目的:探讨CYP1B1对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭、EMT的影响以及与Wnt/β-catenin通路的生物学相关性。方法:在不同的人源结直肠癌细胞株(SW480、SW620、HCT8、HCT116、CaCo-2、DLD-1、LOVO)中,Real-Time PCR 法及 Western Blot 法分别检测 CYP1B1 的 mRNA和蛋白相对表达水平,筛选出CYP1B1相对高表达的两种人源结直肠癌细胞株进行后续实验;在CYP1B1相对高表达的两种人源结直肠癌细胞株中使siRNA下调CYP1B1的表达,分别1.CCK8方法检测细胞增殖曲线,检测结直肠癌细胞增殖数量的变化,Western Blot检测PCNA蛋白表达水平的差异;2.划痕实验、Transwell实验检测癌细胞迁移和侵袭能力的差异,Western Blot检测MMP2、MMP9蛋白表达水平的差异;3.Western Blot 检测 EMT 相关生物学标志物 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白表达水平的差异;4.Western Blot检测细胞核中β-catenin和CyclinD1的蛋白表达水平的差异。在CYP1B1相对高表达的两种人源结直肠癌细胞株中使用XAV939抑制Wnt/β-catenin 通路后,利用 Western Blot 检测 CYP1B1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和细胞核中β-catenin和CyclinD1的蛋白表达水平的差异。结果:在七种人源结直肠癌细胞株中,Real-Time PCR及Western Blot检测结果显示:在HCT8和CaCo-2细胞株中,CYP1B1的mRNA和蛋白表达均相对较高;在HCT8、CaCo-2人源结直肠癌细胞株中下调CYP1B1的表达后:1.CCK8实验检测结果显示结直肠癌细胞的增殖数目减少,差异有统计学意义(P<0.05),Western Blot结果显示PCNA蛋白表达水平均下降,差异有统计学意义(P<0.01);2.划痕实验和Transwell实验结果分别显示结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力减弱,差异有统计学意义(P<0.05),Western Blot结果显示MMP2、MMP9蛋白表达水平均下降,差异有统计学意义(P<0.01);3.Westem Blot结果显示E-cadherin蛋白表达水平增加,差异有统计学意义(P<0.01),而N-cadherin、Vimentin的蛋白表达水平均下降,差异有统计学意义(P<0.01);4.Westem Blot结果显示细胞核内的β-catenin、Cyclin D1的蛋白表达水平均下降,差异有统计学意义(P<0.01)。在人源结直肠癌细胞HCT8、CaCo-2 中使用 XAV939 抑制 Wnt/β-catenin 通路后,Western Blot 结果显示 E-cadherin蛋白表达水平增加,N-cadherin、Vimentin的蛋白表达水平均下降,差异有统计学意义(P<0.01),CYP1B1的蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),细胞核内的β-catenin、Cyclin D1的蛋白表达水平均下降,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:下调CYP1B1的表达能够抑制结直肠癌细胞的增殖,降低结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力,可能会抑制EMT。在细胞生物学功能中,提示下调CYP1B1的表达可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来影响EMT。第三部分:CYP1B1在结直肠癌中的调控机制探讨目的:探讨CYP1B1在结直肠癌中的调控机制方法:选择第一部分研究中的231例结直肠癌患者的术后病理组织继续利用组织芯片技术进一步检测。免疫组化检测B7-H3在肿瘤组织及毗邻癌旁正常组织中的表达,根据约登指数确定B7-H3高低表达的截断值,对每例患者术后病理组织标本中根据免疫组化检测结果探讨B7-H3与CYP1B1表达的相关性,采用Kaplan-Meier法进行生存分析绘制生存曲线,采用Cox比例风险回归模型进行多因素预后分析,探讨B7-H3、YP1B1联合表达对结直肠癌患者生存的影响。Real-Time PCR法及Western Blot法在B7-H3高、低表达人源结直肠癌稳转株细胞(SW480-B7-H3/SW480-NC、CaCo-2-shB7-H3/CaCo-2-NC)细胞中分别检测B7-H3、CYP1B1 的 mRNA 及蛋白表达水平的差异;在SW480-B7-H3、CaCo-2-NC细胞中使用RNAi技术下调CYP1B1的表达后,Real-Time PCR 法及 Western Blot 法检测 B7-H3、CYP1B1 的 mRNA 和蛋白表达水平的差异;Western Blot 法在 SW480-B7-H3/SW480-NC、CaCo-2-shB7-H3/CaCo-2-NC细胞中检测B7-H3、p-Akt蛋白表达水平的差异;在人源结直肠癌SW480细胞株中使用LY294002抑制PI3K-Akt信号通路及IGF-1激活PI3K-Akt 信号通路,Western Blot 法等检测 CYP1B1、p-Akt、Akt、B7-H3 蛋白表达水平的差异。结果:免疫组化检测结果显示,B7-H3阳性染色主要表达于结直肠癌细胞质和细胞膜。与毗邻癌旁正常组织相比,B7-H3在结直肠癌组织中的表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。根据约登指数,确定B7-H3高低表达的截断值为2.75,根据免疫组化结果分析显示,CYP1B1与B7-H3的表达呈现正相关,相关性检验有统计学意义(P<0.05)。生存分析显示:CYP1B1与B7-H3同时高表达患者的预后更差,差异有统计学意义(P<0.05)。在B7-H3高、低表达人结直肠癌稳转株细胞(SW480-B7-H3/SW480-NC、CaCo-2-shB7-H3/CaCo-2-NC)中,Real-Time PCR 和Western Blot结果显示:在mRNA和蛋白表达上CYP1B1与B7-H3的表达呈现正相关关系;使用siRNA下调CYP1B1的表达后,结果显示CYP1B1的mRNA和蛋白表达的水平均下降,差异有统计学意义(P<0.01),但B7-H3的mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。Western Blot 结果显示在 SW480-B7-H3/SW480-NC、CaCo-2-shB7-H3/CaCo-2-NC细胞中,p-Akt的蛋白表达与B7-H3呈现正相关关系。在人源结直肠癌SW480细胞株中,Western Blot检测结果显示B7-H3能够增加CYP1B1和p-Akt的蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.01);加入LY294002抑制PI3K-Akt信号通路后,Western Blot检测结果显示CYP1B1、p-Akt的蛋白表达减少,差异有统计学意义(P<0.01),而B7-H3、Akt蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);加入IGF-1激活PI3K-Akt信号通后,Western Blot检测结果显示CYP1B1、p-Akt的蛋白表达均增加,差异有统计学意义(P<0.01),而B7-H3、Akt蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:在结直肠癌中,体外及体内实验研究结果均显示CYP1B1与B7-H3的表达之间呈现正相关关系。B7-H3可以通过PI3K-Akt信号通路调控CYP1B1的表达。全文结论:1.CYP1B1是结直肠癌的不良预后因素,CYP1B1高表达的结直肠癌患者预后较差。CYP1B1是结直肠癌独立的不良预后因素之一。2.下调CYP1B1的表达能够抑制结直肠癌细胞的增殖,降低结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力,可能会抑制EMT。在细胞生物学功能中,提示下调CYP1B1的表达可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来影响EMT。3.在结直肠癌中,体外及体内实验研究结果均显示CYP1B1与B7-H3的表达之间呈现正相关关系。B7-H3可以通过PI3K-Akt信号通路调控CYP1B1的表达。