甲型流感病毒(InfluenzaAviruses)属于正粘病毒科，其基因组是由8个分节段的单股负义RNA链组成的。历史上暴发过多次甲型流感病毒引起的全球流感大流行，造成大规模人群感染死亡;每年呈季节性流行的H1N1和H3N2甲型流感病毒可造成全球25-50万人感染死亡;近年来不断涌现的各种人感染禽流感病毒死亡事件也均是由甲型流感病毒引发的，因此，系统研究甲型流感病毒有助于加强人类对该病毒防控能力。甲型流感病毒核蛋白(Nucleoprotein，NP)高度保守，是流感病毒诊断与分型的重要靶标;近年来研究发现NP在病毒的复制和增殖过程中起重要作用，使NP逐渐成为一个重要的抗流感病毒治疗靶标，因此，研究甲型流感NP蛋白对该病毒的诊断和抗病毒治疗均具有重要意义。表位研究对于病毒的诊断和抗病毒治疗均具有重要指导意义，但迄今NP中的B细胞表位仍罕见报道，可能与NP作为一个多聚体蛋白而构象复杂有关。本课题组前期在开发甲型流感病毒诊断试剂中曾积累了一批NP特异性单抗，本研究拟在此基础上，进一步对这些NP单抗进行表位鉴定，发现潜在的保守性B细胞表位，并研究表位的相关功能，以期对流感病毒的预防和治疗提供科学依据。本研究取得以下研究结果:　　第一，用禽源和人源NP蛋白把NP单抗分成三类。首先，选取禽源流感病毒分支上的代表株A/HK/212/03（H5N1，HK/212）及人源流感病毒分支上的代表株A/California/04/2009(H1N1，CA/04)的NP基因，用大肠杆菌重组表达rNP-HK/212和rNP-CA/04;其次分别检测了NP单抗盘对禽源rNP-HK/212及人源rNP-CA/04两种重组NP蛋白的反应性，根据单抗同两类NP抗原的反应性可将单抗库分成三类（ClassA，ClassB和ClassC），其中ClassA类单抗对两种NP重组蛋白均有很好的反应性，ClassB类单抗对禽源rNP-HK/212有很好的反应性，但对人源rNP-CA/04不反应;ClassC类单抗对人源rNP-CA/04有很好的反应性，对禽源rNP-HK/212的反应性明显减弱，说明ClassA类单抗是广谱单抗，ClassB类单抗能特异性识别禽宿主流感病毒。　　第二，用重组NP片段把广谱NP单抗（ClassA类）分成三类。首先，用大肠杆菌重组表达rNP-HK/212三个rNP分段基因亚克隆重组抗原，然后用F1(1-120aa)、F2(110-301aa)、F3(293-498aa)及全长rNP这四种抗原对ClassA类广谱单抗进行Westernbloting分析，根据反应性强弱，把单抗分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类单抗，其中Ⅰ类单抗对全长rNP和F2片段有反应，Ⅱ类单抗对全长rNP有反应，对F1、F2、F3片段无反应，第Ⅲ类单抗则对四种重组抗原均无反应，说明Ⅰ类单抗可能识别NP的线性表位，Ⅱ、Ⅲ类单抗主要识别NP的构象表位。　　第三，Ⅰ类线性NP单抗的发现及表位鉴定。上述研究发现Ⅰ类单抗对全长rNP及F2片段有Westernbloting反应，以4D2作为单抗代表运用Westernbloting，Immunofluorescence，Co-Immunoprecipitation，Immunohistochemistry方法验证了Ⅰ类单抗对天然病毒有良好的反应性，并最终证明Ⅰ类单抗识别NP的保守线性表位“RESRNPGNA”，介于NP的第243-251氨基酸之间，是迄今为止第一个NP线性B细胞表位。该线性表位和线性单抗的发现，有望发展成为一个有用的蛋白表达与纯化的标签。　　第四，Ⅱ类广谱构象性单抗的识别表位关键氨基酸鉴定，并探索其潜在功能。上述研究中Ⅱ类单抗对全长rNP有Westernbloting反应，对F1、F2、F3片段无反应，提示Ⅱ类单抗可能识别的是NP的构象表位，首先调取Ⅱ类单抗代表株19C10的可变区基因，运用分子对接分析方法得到7个预测氨基酸，其次结合点突变最终确定D88为构象表位的关键位点，进而结合冷冻电镜对NP单体的原子结构进行预测，证明NP的D88是影响NP同PB2结合的关键位点，同时也影响RNP的合成。　　第五，鉴定禽宿主特异性的ClassB类单抗的识别表位，并建立一种适合禽流感特异性检测的诊断方法。首先利用氨基酸比对及分子模拟预测关键位点，其次利用点突变进行验证，成功发现人禽流感病毒NP第100位氨基酸为造成宿主差异性的关键位点，并开发为特异性识别禽流感NP的诊断试剂盒。　　总之，本研究发现了一个NP的B细胞保守线性表位243RESRNPGNA251，同时发现一个NP构象B细胞表位的关键氨基酸D88，并证明该位点能影响NP同PB2的结合进而影响RNP的合成及病毒的复制功能，同时发现了人禽宿主差异的流感病毒NP保守性表位并成功开发了特异性识别禽流感的诊断试剂，对流感病毒的预防和治疗提供科学依据，对流感病毒的诊断和抗病毒治疗有重要意义。