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抗生素的广泛应用对于人类的健康和社会的发展功不可没,但随着科学进步和人们对生物演变认识的不断提高,抗生素对人类的危害也日益明确,已引起人们越来越多的关注。目前分子生物学研究中所用载体,均以抗性基因作为筛选标记。消旋酶在生物体内的主要功能是将L-型氨基酸转变生成相应的D-型氨基酸,供多数细菌细胞壁肽聚糖层合成需要。研究表明,消旋酶基因的缺失对菌株的生长是致死的,而在一般的培养基组分中不含有D-型氨基酸,因此消旋酶基因可以作为遗传操作中的选择标记使用。本实验以菌株Escherichia coli DH10B为研究对象,利用Red重组系统介导的基因敲除技术,依次成功敲除了基因组上两个丙氨酸消旋酶基因alr、dadX;得到的突变株DH10B-Δalr-AdadX-1为D-丙氨酸营养缺陷型。突变株对D-丙氨酸具有严格的依赖性,LB培养基中含终浓度50 μmol·L-1的D-丙氨酸是维持其生长的最低浓度,终浓度200μmol·L-1的D-丙氨酸可使其正常生长。生长曲线测定结果表明,与野生菌DH10B相比,突变株在整个生长时期的生长速度正常但菌体浓度稍低,测得对数期中期和稳定期的OD600nm值相差约0.5；且在对数期中期和稳定期,突变株的菌落数目约是野生菌的一半。但镜检菌落形态却未发现明显差异。通过回补实验验证回复了突变株的功能,表明D-丙氨酸可作为菌体生长的选择压力。基于以上研究理论和实验结果,我们通过重叠延伸PCR的方法构建了一个无抗性载体pECO21。载体pECO21保留了目前克隆载体所具有的一般特性,不同的是载体pECO21采用D-丙氨酸作为筛选标记。由于载体pEC021在多克隆位点处具有BamHI酶切位点,因此它不仅可用于普通克隆系统,还可用于细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,简称BAC)文库的构建,可达到90%的酶连效率。