研究背景与目的深静脉血栓(Deep Venous Thrombosis,DVT)形成是指深静脉血管腔内血液异常凝结导致脉管腔血回流障碍,常发生于下肢,表现为局部静脉曲张、肿胀疼痛、皮肤发热等症[1]。Naess IA等[2]指出血栓栓塞症、深静脉血栓形成及肺栓塞每年病率分别为1.43%、0.93%、0.50%,且在逐年增加。DVT在临床很常见,易反复发作,如果不能及时的给予积极有效的临床治疗干预,往往会导致患者发生严重的后果,严重时会导致患者发生猝死[6]。其病因与静脉血流缓慢、血液高凝状态及静脉血管壁损伤三大因素具有密切关系[8-9]。Vigneaud学者于1932年首次发现同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)是甲硫氨酸转甲基代谢的中间产物[12]。有学者研究表明,高同型半胱氨酸水平与早发的心梗、中风以及在青少年阶段引起死亡的动脉粥样硬化和血栓栓塞有关[15]。Hcy最早被证明是心血管疾病的独立危险因素是在1976年,该结论是通过Wilcken等[16]的流行病学调查得出的。相继有大量研究证实,高同型半胱氨酸(High homocysteine,HHcy)是心脑血管疾病独立的危险因素[17-18],而国内关于其与静脉血栓栓塞性疾病的研究却很少报道。1985年国外学者就意识到Hcy相关的血管疾病51%是静脉源性的,但是直到1991年Hcy与DVT有相关性的文章才发表[19]。许多研究表明Hcy与DVT有相关性[20-21],并且,大量研究还表明[22-23]高Hcy血症是DVT的独立危险因素。不仅如此,高Hcy血症还被证明与血管危险性之间呈剂量依赖关系[24]。所以,高Hcy血症是下肢DVT一个新的不容轻视的危险因素。在Hcy代谢过程中,叶酸和VB12发挥着重要作用,既往研究表明,叶酸和VB12摄入不足导致Hcy水平增高占所有HHcy发病者2/3[25],体外研究也显示,Hcy水平可因同时补充叶酸、VB12而有效控制并降低[26]。叶酸缺乏是导致高Hcy血症的常见原因,但是叶酸不能体内自身合成,必须经饮食或药物补充,那么,补充两种药物对高Hcy血症合并下肢DVT是否有较好的疗效?不同剂量的叶酸、维生素B12干预对DVT伴高同型半胱氨酸血症所产生的效果是否一致?高血浆Hcy的代谢过程和叶酸、维生素B12紧密相关。那么,叶酸、维生素B12对高同型半胱氨酸血症并下肢深静脉血栓形成患者的血栓复发的预防是否有一定的效果呢?这些都是本文需要探讨的问题。本研究第一章将通过构建新西兰大白兔高同型半胱氨酸血症HHcy伴深静脉血栓模型,第二章在此基础上体外条件下给予不同剂量的叶酸、维生素B12进行干预,前瞻性的考察其治疗效果,本研究第三章主要揭示叶酸、维生素B12对高同型半胱氨酸血症并下肢深静脉血栓形成患者血栓复发的影响。方法1.用含1%蛋氨酸的饲料喂养新西兰大白兔,建立HHcy模型,再用阻断法构建兔左后肢股静脉DVT模型,为后续研究奠定坚实的实验基础。2.体外研究:将造模成功的HHcy伴DVT新西兰大白兔随机分为模型对照组(使用生理盐水)、低剂量组(叶酸片5 mg/d+维生素B12片0.25 mg/d)及高剂量组(叶酸片15mg/d+维生素B12片0.5 mg/d)。测定各组血液流变学、凝血功能、血浆Hcy、D-二聚体变化,半定量RT-PCR检测血管组织TF m RNA的表达,光镜下观察各组兔下肢深静脉血栓病理组织学改变,各组血栓预后情况采用彩色多普勒超声进行观察。3.临床研究:选择2015年1月-2016年7月我院收治的高同型半胱氨酸血症并下肢深静脉血栓形成患者90例为研究对象,随机分成2组,各45例。干预组口服叶酸、维生素B12治疗,非干预组则不采用叶酸、维生素B12治疗。总结其发病特点,并观察发病分布的规律,对比两组的一般临床资料,分析Hcy与性别、年龄、血清指标的相关性,对比分析两组Hcy、叶酸、维生素B12水平,探讨干预组患者Hcy与叶酸、维生素B12的相关性,比较分析两组患者抗凝血国际标准化比值(INR),详细记录INR的首次达标时间、稳定值时间、获INR稳定值时间、活化部分凝血活酶时间(APTT)、血浆凝血酶原时间(PT),观察两组血栓复发的情况。结果1.采用饲料中含1%蛋氨酸喂养第4周后,63只新西兰大白兔血清Hcy的浓度为(12.18±1.23)μmol/l。结扎后,共有3只兔死亡,存活的60只兔子左后肢股静脉阻断法DVT模型造模成功率为100%。2.新西兰大白兔造模后3 d与造模后10 d,高剂量组与低剂量组血液流变学、凝血功能指标较模型对照组组间比较,差异显著,有统计学意义(P<0.05),高剂量组明显优于低剂量组(P<0.05)。建模前,三组的Hcy、D-二聚体水平比较差异无统计学意义(P>0.05),建模后10 d,高剂量组与低剂量组的Hcy、D-二聚体水平较模型与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),且高剂量组明显低于低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。建模10d后低剂量组、高剂量组TFm RNA相对表达量均低于对照组,且依对照组、低剂量组、高剂量组呈现剂量依赖性下降趋势(P<0.05=。建模10 d后,与模型对照组比较,高剂量组、低剂量组兔下肢深静脉血栓病理组织学改变明显减轻,而高剂量组改善程度最佳。建模10 d后,高剂量组下肢深静脉血栓治疗有效率为100%,均高于低剂量组及模型对照组(P<0.05)。3.本组中男、女发病高峰均为50-59岁;双下肢、右下肢、左下肢血栓构成比分别为8.89%、25.56%、65.55%,两两之间比较均有显著性差异(P<0.05);周围型、中央型、混合型血栓的构成比分别为24.07%、29.63%、46.30%,周围型与中央型比较差异不显著(P>0.05),而混合型与周围型、中央型比较均有统计学差异(P<0.05);同时采用肢静脉造影和彩色多普勒超声检查对股-腘静脉、髂静脉、腘静脉检查,结果血栓检出率分别为29.63%和28.70%、23.15%和11.11%以及46.30%和32.41%,两种检查技术在股-腘静脉处血栓检出率差异无显著性(P>0.05),但在髂静脉、腘静脉以下处差异有显著性(P<0.05);两组患者的性别、年龄、体重、其他生化指标包括肝肾功能、血栓的类型、患肢血栓的分布情况比较无统计学差异(P>0.05);男、女患者比较,Hcy水平无差异(P>0.05);但是≥60岁组与另外两组比较有显著差异(P<0.05;血清Hcy水平与各项血清学指标均无相关关系(P均≥O.05);与干预前比较,干预组干预后Hcy明显下降(P<0.05),而干预组叶酸、维生素B12水平显著上升(P<0.05),非干预组患者干预前后Hcy、叶酸、维生素B12水平比较差异无统计学意义(P>0.05);干预组患者Hcy与叶酸呈负相关(r=-0.376,P<0.05);干预组患者Hcy与维生素B12呈负相关(r=-0.583,P<0.05);干预后,干预组INR首次达标时间、稳定值时间、获INR稳定值时间均优于非干预组(P<0.05);干预组APTT及PT平均值低于非干预组(P<0.05);干预组下DVT再发生率低于非干预组(4.4%vs28.9%,P<0.05。结论1.蛋氨酸饮食负荷复制兔高同Hcy血症模型,符合高Hcy血症的诊断标准,说明高Hcy血症模型建成;兔子左后肢股静脉结扎DVT后下肢深静脉血栓形成率为100%,说明成功建立兔DVT伴高同Hcy血症模型。2.与低剂量的叶酸、维生素B12比较,高剂量的叶酸、维生素B12用于兔DVT伴高Hcy血症治疗,可以显著降低血浆Hcy、D-二聚体水平,明显改善下肢静脉血栓病理组织改变程度。3.Hcy与叶酸、维生素B12均呈负相关。叶酸、维生素B12可降低高Hcy血症并下肢深静脉血栓形成患者血栓复发率,其作用机制可能是通过降低Hcy水平来预防血栓的复发。