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第一部分诱导并鉴定特异性视网膜Müller细胞VEGFR2基因敲除的小鼠模型目的成功诱导出特异性视网膜Müller细胞上血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)基因敲除的小鼠,为研究生理及糖尿病条件下视网膜Müller细胞VEGFR2的作用提供动物模型。方法利用视网膜Müller细胞特异性表达Cre重组酶的小鼠与VEGFR2/loxP转基因小鼠进行杂交。自妊娠后第15天(E15)至产后第1天(P1)给孕鼠喂食含强力霉素(2mg/ml)的5%蔗糖溶液。取P15小鼠长约2mm尾巴组织,应用PCR检测Cre及VEGFR2基因,明确各小鼠基因型,然后根据基因型将小鼠分为特异性Müller细胞VEGFR2基因敲除组(knockout,KO)和基因未敲除组(wildtype,WT);P7时取两组小鼠视网膜组织进行原代Müller细胞培养,免疫组化及Western blot检查VEGFR2的表达情况;4周时应用免疫组化及免疫印迹检测WT及KO小鼠视网膜VEGFR2蛋白的表达及分布;8周时视网膜电位图(ERG)检测视网膜功能,HE染色比较两组小鼠视网膜形态及结构。结果与野生型原代Müller细胞相比,KO小鼠原代Müller细胞VEGFR2蛋白表达量下降了87%(P<O.001),视网膜免疫组化结果表明减少的VEGFR2信号主要来自视网膜Müller细胞,而其它各层VEGFR2表达差异不明显;4周时两组间Scotopic ERG及Photopic ERG的a波及b波均无统计学差异(P>0.05);组织切片结果显示:特异性视网膜Müller细胞VEGFR2基因敲除与未敲除小鼠视网膜外核层、内核层及平均厚度和神经节细胞数量差异均无统计学意义(P>0.05)。结论本实验方法可成功诱导出特异性视网膜Müller细胞VEGFR2基因敲除的小鼠,为研究生理及病理条件下视网膜Müller细胞VEGFR2的作用提供动物模型。第二部分VEGFR2信号对正常及糖尿病小鼠视网膜Müller细胞存活的影响目的研究在正常及糖尿病条件下,视网膜Müller细胞VEGFR2对Müller细胞自身存活的影响。方法分别将WT及KO原代Müller细胞置于含高渗葡萄糖(25mmol/L)及低渗葡萄糖[(5mmol/L葡萄糖)+20mmol/L甘露醇]培养液中培养72h,TUNEL凋亡检测法检测Müller细胞凋亡情况;Western blot检测Müller细胞p-Akt信号变化。采用随机分组的方法,将WT及KO小鼠分别分为糖尿病和非糖尿病组。糖尿病组小鼠被腹腔内注射链脲佐菌素(STZ),连续5天,每次注射前均禁食8h,非糖尿病组小鼠注射等体积柠檬酸缓冲液作为对照。定期监测血糖和体重,当小鼠血糖浓度超过300mg/dl时被视为造模成功。分别于糖尿病模型诱导成功4、7、10个月后,免疫组化观察Müller细胞形态及数量的变化。结果WT及KO原代Müller细胞经低渗糖培养基培养72h后,细胞凋亡数量及p-Akt表达均无统计学差异(P>0.05);而经高渗糖培养72h后,相对WT原代Müller细胞,KO原代Müller细胞发生凋亡的数量明显上升,且p-Akt表达下降,差异有统计学意义(P<0.001,P<0.01)。糖尿病模型建成后2个月,糖尿病组小鼠的体重明显低于非糖尿病组小鼠,而血糖浓度明显高于非糖尿病组小鼠,两组之间差异有统计学意义(P<0.001)。而非糖尿病WT组与KO组、糖尿病WT组与KO组比较,小鼠的血糖浓度和体重的差异无统计学意义(P>0.05)。在糖尿病4个月时,两组间无明显差异,但在糖尿病7、10个月时,KO小鼠Müller细胞结构破坏逐渐加重,其数量随病程逐渐减少分别至76%、53%,与同龄的WT糖尿病小鼠比较均有统计学意义(P<0.01,P<0.001)。而在非糖尿病状态下,WT及KO两组间Müller细胞形态结构及数量均无统计学差异(P>0.05)。结论VEGFR2信号对糖尿病小鼠视网膜Müller细胞存活具有重要的作用。第三部分VEGFR2信号介导的视网膜Müller细胞在糖尿病视网膜神经细胞病变中的作用目的研究糖尿病条件下视网膜Müller细胞上VEGFR2信号在糖尿病视网膜神经细胞病变的作用。方法按基因型将小鼠分成KO和WT两组,然后随机将每组分为糖尿病组及非糖尿病组,STZ诱导建成I型糖尿病模型。分别于糖尿病模型诱导成功4、7、10个月后,利用ERG评价视网膜功能;组织切片HE染色分析视网膜外核层、内核层厚度及神经节细胞数;免疫荧光分析S-cone、M-cone的表达及外核层、内核层、神经节细胞凋亡数量;Western blot检测各组小鼠视网膜p-Akt、BDNF、GDNF的表达。结果糖尿病模型建成后2个月,糖尿病组小鼠的血糖浓度明显高于非糖尿病组小鼠,体重下降明显,差异有统计学意义(P<0.001)。糖尿病模型建成后4个月时,两组间ERG、内核层、外核层、神经节细胞数量、S-cone、M-cone的密度均无显著差异,到7及10个月时,KO糖尿病组小鼠a波及b波波幅及内核层、外核层、神经节细胞数量、S-cone、M-cone的密度均降低,差异均有统计学意义;糖尿病模型建成4个月后,TUNEL凋亡检测发现KO糖尿病组小鼠外核层、内核层、神经节细胞层细胞凋亡增加,分别升高了90%、123%、210%。Western Blot结果显示,敲除视网膜Müller细胞VEGFR2使糖尿病视网膜p-Akt、BDNF、GDNF的表达降低,其表达量分别下降了42%、67%、77%。结论视网膜Müller细胞通过VEGFR2信号通路对糖尿病条件下视网膜神经细胞存活具有重要作用,是糖尿病视网膜神经细胞存活信号的重要细胞来源。