拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国重要的海水养殖经济蟹类之一。近年来,青蟹的人工养殖规模不断扩大,但在青蟹的人工育苗和养殖过程中因容易受水质、微生物感染等导致存活率仍较低,同时养殖业抗生素药品的大量使用使病原微生物的耐药性不断增加,这些都极大地限制了产业的发展。因此对青蟹免疫机制的研究具有十分重要的意义。酚氧化酶系统是无脊椎动物特有的一套非自身识别免疫系统,尤其是在节肢动物的免疫机制中具有非常重要的作用。血蓝蛋白是一类在节肢动物和软体动物中负责运输氧气的含铜呼吸蛋白。近年来很多研究表明节肢动物的血蓝蛋白和酚氧化酶具有同源关系,结构上非常相似,且在一定条件下血蓝蛋白又具有酚氧化酶活性。本研究主要通过构建拟穴青蟹的c DNA文库,借助c DNA末端快速扩增(RACE)技术和实时荧光定量PCR技术对拟穴青蟹酚氧化酶原激活系统中的两个相关基因以及血蓝蛋白基因进行了克隆和不同模式下的表达分析,并利用生物信息学的方法对获得的序列进行了分析研究,试图从分子生物学的角度来探讨这些基因之间的关系以及它们在拟穴青蟹免疫过程中的作用,以期为缓解拟穴青蟹养殖业的病害问题提供重要的理论基础。本文主要研究结果总结如下:1、酚氧化酶原激活酶(PPAF)是一类含有clip结构域的丝氨酸蛋白酶,可以激活无活性的酚氧化酶原(pro PO),从而引起病原菌的黑化反应,是酚氧化酶系统的关键组成部分。本文克隆到了拟穴青蟹PPAF1和PPAF2两个基因的c DNA全长,比对结果显示它们与其他物种的PPAF具有较高的同源性,综合分析后分别命名为Sp PPAF1和Sp PPAF2。Sp PPAF1序列c DNA全长为1677bp,其中包括52bp的5’-末端非转录区(5’-UTR),1131bp的ORF和494bp的3’-末端非转录区(3’-UTR),共编码376个氨基酸,预测蛋白分子量38.43 k Da。Sp PPAF2序列c DNA全长为1808bp,其中包括88bp的5’-UTR,1125bp的ORF和595bp的3’-UTR,共编码374个氨基酸,预测蛋白分子量38.56 k Da。Sp PPAF1和Sp PPAF2都含有如下结构:信号肽区域、一个典型的N端clip结构域和具有催化活性的C端丝氨酸蛋白结构域。两者氨基酸序列相似性为81.0%。荧光定量PCR实验结果显示Sp PPAF1和Sp PPAF2在7个组织(血液、肝胰腺、鳃、精巢、心脏、肌肉和卵巢)中均有表达,其中Sp PPAF1在鳃、精巢和血液中表达量较高,Sp PPAF2主要在血液中表达。用副溶血弧菌感染处理大眼幼体,结果显示Sp PPAF1和Sp PPAF2的表达量除了感染的前6 h变化趋势有略微不同外,在接下来的6 h都显著升高,至12h时达到最大值,随后下降,至72 h时基本恢复正常水平。结果表明拟穴青蟹中PPAF可能与机体对外来病原的免疫防御作用密切相关,作用周期大约为72 h。2、酚氧化酶原(pro PO)是一种含铜的保守酶,也是酚氧化酶原激活系统的关键组成部分和黑色素生成的关键酶。本文获得了拟穴青蟹pro PO基因的c DNA全长,比对结果显示它与其他物种的pro PO具有较高的同源性,经综合分析后确定命名为Sppro PO。该序列全长为2688bp,其中包括40bp的5’-UTR,2133bp的ORF和515bp的3’-UTR,共编码710个氨基酸,预测蛋白分子量约为81.5 k Da,等电点约为6.01。序列分析结果显示Sppro PO含有三个串联的血蓝蛋白保守结构域和两个保守的铜离子结合位点。运用荧光定量PCR技术检测了Sppro PO在拟穴青蟹不同组织中的表达差异情况,结果显示Sppro PO在拟穴青蟹的7个不同组织中均有表达,其中在血液和精巢中表达量较高,在心脏中的表达量最低。本实验为深入研究拟穴青蟹酚氧化酶原基因的结构和功能奠定了基础。3、血蓝蛋白(Hc)是许多节肢动物和软体动物中重要的呼吸蛋白,为动物的生存提供了重要的支撑。本文克隆到了拟穴青蟹中Hc1、Hc2、Hc3和Hc4四个基因的c DNA全长,比对结果显示它与其他物种的Hc具有较高的同源性,综合分析后分别命名为Sp Hc1、Sp Hc2、Sp Hc3和Sp Hc4,全长分别为2281 bp,2002 bp,2184 bp和2069 bp,分别编码676,570,672和671个氨基酸,预测蛋白分子量分别为76.8,65.0,76.3和76.4 k Da。序列分析结果显示Sp Hc含有三个串联的血蓝蛋白保守结构域和两个保守的铜离子结合位点。运用荧光定量PCR技术研究了血蓝蛋白基因在拟穴青蟹各个不同组织,溞状幼体Z1-Z5期、大眼幼体M期以及仔蟹C1期等7个不同发育阶段的时空表达差异。分析结果表明Sp Hc在各个组织中均有表达,其中主要在肝胰腺、精巢和血液中表达;另外,在不同的发育时期也均有表达,其中在前6个发育时期时,Sp Hc3和Sp Hc4的表达量要显著高于Sp Hc1和Sp Hc2,但到仔蟹期时Sp Hc3和Sp Hc4的表达量突然下降,低于Sp Hc1和Sp Hc2。副溶血弧菌感染试验结果表明:在感染后的前3 h内,Sp Hc的表达量明显下降,在随后的9 h逐渐上升,至12 h时达到最大值。研究结果说明血蓝蛋白基因可能参与了拟穴青蟹的免疫抗菌过程,且四个血蓝蛋白基因在拟穴青蟹不同发育时期可能发挥着不同的作用,Sp Hc3和Sp Hc4可能在青蟹浮游生活时期发挥主要作用,而Sp Hc1和Sp Hc2可能在其底栖及以后的生活中发挥主要作用。综上所述,本研究共克隆得到了7个与拟穴青蟹酚氧化酶系统相关的基因的c DNA全长序列,并研究了他们在拟穴青蟹中不同模式下的表达差异情况。研究结果初步揭示了拟穴青蟹酚氧化酶系统及血蓝蛋白的分子基础以及应对微生物感染的调控趋势,为今后这些基因的功能研究奠定了基础。