邻苯二甲酸二(2—乙基)己酯(Di-(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP)是塑料工业中使用最广泛的一类增塑剂,它主要用来增加塑料的弹性和柔韧性。由于DEHP在塑料中以非共价键形式存在,并可随着使用时间的推移而不断释放至大气、土壤和水体中,人体可通过呼吸道、消化道和皮肤多途径持续地暴露于环境中的DEHP。为此,DEHP的潜在健康危害已倍受国内外学者的关注。研究表明,进入机体的DEHP很快被代谢为活性中间产物—邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯mono-(2-ethylhexyl) phthalate, MEHP),产生肝脏毒性、肾脏毒性和生殖发育毒性等。体外研究显示,MEHP可致多种细胞的凋亡,但尚不了解其分子调控机制。MEHP是过氧化物酶体增殖物(peroxisome proliferators, PP),它可经氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators activated receptors, PPAR)介导肝毒性。但是,MEHP致肝毒性的调控机制并非完全依赖PPAR途径,可能与孕烷X受体(pregnane X receptor, PXR)有一定的关联。细胞凋亡是外环境刺激或死亡信号所触发的细胞主动死亡过程,该过程受多个基因的调控,其中抑癌基因p53发挥主要调控作用。活化p53通过转录调控下游凋亡基因,如bax-, bcl-2和puma等激活线粒体凋亡通路引起细胞凋亡。研究发现,在MEHP引起的生殖细胞凋亡过程中有p53蛋白的高表达。但是,细胞凋亡并非仅受p53介导的细胞信号通路的调控,p53非依赖信号通路,如c-Jun氨基末端激酶-促分裂素原活化蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinases-mitogen activated protein kinases, JNK-MAPK)途径和Fas/FasL途径等也可参与其调控。不过迄今仍不清楚在MEHP致肝细胞凋亡中p53依赖性和非依赖性信号通路是否参与了调控。基于此,本研究拟用MEHP处理人胚肝细胞L02和人肝癌细胞HepG2来研究MEHP致肝细胞毒性和氧化损伤变化,以及p53介导的线粒体通路在MEHP致肝细胞凋亡中的调控机制,并探索性研究Fas/FasL在p53非依赖性信号通路调控MEHP致肝细胞凋亡中的作用,旨在为后续深入研究MEHP致肝细胞毒性的分子机制提供科学依据。本研究包括以下三个部分：第一部分MEHP致人肝细胞氧化性DNA损伤和细胞凋亡的研究目的：建立MEHP染毒L02细胞和HepG2细胞模型。方法：MEHP设定浓度为6.25μM、12.50μM、25.00μM、50.00μM和100.00μM,二甲基亚砜(DMSO)为溶剂对照(终浓度≤0.1%),检测内容包括：①MTT检测细胞活力；②试剂盒检测细胞丙二醛(maleic dialdehyde, MDA)水平、超氧化物酶(superoxide dimutese, SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)的活性；③高效液相色谱仪(HPLC)检测细胞8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)水平；④流式细胞仪和TUNEL检测细胞凋亡变化。研究结果如下：(一)细胞活力①用MEHP处理L02细胞12h,仅在50.00μM处理组检出细胞活力上升(p<0.05)；在24h时点,50.00μM和100.00μM处理组的细胞活力均显著性降低p<0.05或p<0.01)；在36h时点,较高浓度MEHP处理组(≥25.00μM)细胞的活力均显著性降低(p<0.05或p<0.01)。②用MEHP处理HepG2细胞12h,在50.00μM和100.00μM处理组的细胞活力显著性下降(p<0.01)。在24h和36h时点,细胞活力随MEHP浓度的升高而逐渐降低,在较高浓度的MEHP处理组(≥25.00μM),细胞活力均显著性降低p<0.01)。(二)细胞的氧化损伤①用MEHP处理L02细胞和HepG2细胞12h,在所有处理组均未观察到MDA水平的变化p>0.05)。在24h和36h时点,较高浓度的MEHP处理L02细胞(≥25.00μM)的MDA水平均显著性升高p<0.05或p<0.01)。用MEHP处理HepG2细胞24h,所有处理组的MDA水平均显著性升高(p<0.01)；在36h时点,除6.25μM处理组外,所有MEHP处理组的MDA水平均显著性升高(p<0.01)。②用MEHP处理L02细胞12h,所有处理组细胞的SOD活性均无显著性变化(p>0.05)；在24h时点,所有处理组细胞的SOD活性均显著性降低(p<0.05或p<0.01)；在36h时点,较高浓度MEHP处理组(≥25.00μM)细胞的SOD活性也显著性降低p<0.01)。MEHP处理HepG2细胞12h,所有MEHP处理组细胞的SOD活性均无显著性变化(p>0.05)；在24h时点,仅观察到100.00μM处理组细胞的SOD活性降低(p<0.05)；在36h时点,50.00μM和100.00μM处理组细胞的SOD活性均降低p<0.05)。③MEHP处理L02细胞12h和24h,所有MEHP处理组均为观察到细胞GSH-Px活性的变化p>0.05)；在36h时点,除6.25μM处理组外,其他处理组细胞的GSH-Px活性均降低p<0.05)。用MEHP处理HepG2细胞12h,在所有处理组未观察到GSH-Px活性的变化(p>0.05)；在24h和36h时点,除6.25μM处理组外,其他处理组细胞的GSH-Px活性均显著性降低p<0.05)。(三)细胞8-OHdG水平①MEHP处理L02细胞24h和36h,仅在24h时点的50.00μM和100.00μM处理组和36h时点的100.00μM处理组8-OHdG水平有显著性升高p<0.05或p<0.01);②MEHP处理HepG2细胞24h和36h,在24h时点>25.00μM的各处理组和36h时点的100.00μM处理组细胞的8-OHdG水平有显著性升高p<0.05或p<0.01)。(四)细胞凋亡①流式细胞仪检测结果显示：MEHP处理L02细胞24h和36h,在50.00μM和100.00μM处理组的细胞凋亡率均显著性增加(p<0.01)。MEHP处理HepG2细胞24h和36h,观察到24h时点100.00μM处理组和36h时点>25.00μM各处理组的细胞凋亡率显著性增加(p<0.01)。②TUNEL结果显示：MEHP处理L02细胞24h和36h,50.00μM和100.00gM处理组有绿色荧光标记的凋亡细胞数明显增多。MEHP处理HepG2细胞24h,仅发现100.00μM组绿色荧光标记的凋亡细胞略有增多；在36h时点,在25.00μM处理组已发现绿色荧光标记的凋亡细胞数有明显增多。结论：MEHP可致L02细胞和HepG2细胞氧化应激和氧化性DNA损伤,并导致细胞凋亡。第二部分p53介导线粒体通路在MEHP致肝细胞凋亡中的调控作用第一部分研究结果提示：MEHP并非完全依赖于PPAR途径致肝细胞凋亡。因此,本部分将进一步研究PXR受体途径的相关基因、蛋白质表达水平和酶活性的变化,以及p53介导线粒体通路在MEHP致L02细胞和HepG2细胞凋亡中的调控作用。方法：MEHP设定浓度为6.25μM、12.50μM、25.00μM、50.00μM和100.00μM,二甲基亚砜(DMSO)为溶剂对照(终浓度≤0.1%),检测内容包括：①实时荧光定量RT-PCR检测pxr基因mRNA表达；②estern blotting检测CYP3A4蛋白表达,7-乙氧基香豆素O-去乙基酶(ECOD)检测CYP3A4酶活性；③estern blotting检测p53、p-p53、MDM2、 Bax、Bcl-2、PUMA和NOXA蛋白表达；④HPLC检测细胞ATP含量；⑤Westem blotting检测胞浆内Cytochrome c和Smac/DIABLO蛋白含量；⑥试剂盒检测caspase3,9酶活性。研究结果如下：(一)PXR受体途径相关基因、蛋白及酶活性①MEHP处理L02细胞24h,除6.25μM组外,其他处理组pxr基因的mRNA表达均被上调(p<0.05或p<0.01)。在36h时点,所有处理组pxr基因的mRNA表达均被上调(p<0.05或p<0.01)。MEHP处理HepG2细胞24h,在>25.00μM的各处理组pxr基因mRNA表达均被上调(p<0.05或p<0.01)。在3.6h时点,除6.25μM处理组外,其他处理组pxr基因mRNA表达均被上调(p<0.01)。②MEHP处理L02细胞24h,50.00μM和100.00μM处理组CYP3A4蛋白表达量增加p<0.01)。在36h时点,除6.25μM处理组外,其他处理组CYP3A4蛋白表达量均增加(p<0.05或p<0.01)。MEHP处理HepG2细胞24h,除6.25μM处理组外,其他处理组CYP3A4蛋白表达量增加(p<0.05或p<0.01)。在36h时点,>25.00μM的各处理组CYP3A4蛋白表达均增加(p<0.01);③MEHP处理L02细胞24h,50.00μM和100.00gM处理组ECOD酶活性均显著性升高(p<0.05或p<0.01)；在36h时点,≥25.00μM的各处理组ECOD活性均显著性升高(p<0.01)。 MEHP处理HepG2细胞24h和36h,所有处理组ECOD活性均显著性升高(p<0.05或p<0.01)。(二)细胞凋亡相关蛋白的表达水平①MEHP处理L02细胞36h,检出50.00μM和100.00μM处理组MDM2蛋白表达的下调(p<0.05)；除6.25μM处理组外,其他处理组p53及其磷酸化蛋白均被上调(p<0.05或p<0.01)o p53/MDM2比值从12.50μM处理组开始即被上调(p<0.01)。在≥25.00μM的各处理组均检出Bax蛋白表达上调(p<0.01),但Bcl-2蛋白在50.00μM和100.00μM处理组则下调p<0.05或p<0.01)。所有处理组的Bax/Bcl-2比值均升高p<0.05或p<0.01)o PUMA和NOXA蛋白表达在≥25.00μM的各处理组均被上调(p<0.05或p<0.01)。②MEHP处理HepG2细胞36h,仅在100μM处理组检出MDM2蛋白表达下调(p<0.05),而在所有处理组的p53蛋白表达则检出上调(p<0.05或p<0.01),在≥25.00μM的各MEHP处理组均检出磷酸化p53蛋白表达上调(p<0.01)。所有处理组的p53/MDM2比值均被上调(p<0.01)。仅在100.00μM处理组检出Bax蛋白表达上调(p<0.05),但在100.00μM处理组则检出Bcl-2蛋白表达下调(p<0.05)。除6.25μM组外,其他处理组均检出Bax/Bcl-2比值的升高(p<0.05或p<0.01)。在≥12.50μM的各MEHP处理组均检出PUMA和NOXA蛋白表达上调(p<0.05或p<0.01)。(三)细胞线粒体损伤指标①MEHP处理L02细胞24h,除6.25μM和12.50μM处理组外,其他处理组的ATP含量均显著性降低(p<0.05或p<0.01)。在36h时点,50.00μM和100.00μM处理组ATP含量也显著性降低(p<0.01)。MEHP处理HepG2细胞24h和36h,除36h时点的6.25μM处理组外,其他处理组的ATP含量均显著性降低(p<0.01)。②MEHP处理L02细胞36h,所有MEHP处理组的胞浆中细胞色素C(Cytochrome c)的含量均显著性升高(p<0.01)。除6.25μM和12.50μM处理组外,其他处理组胞浆中Smac/DIABLO的含量均显著性升高(p<0.05或p<0.01)。MEHP处理HepG2细胞36h,除6.25μM处理组外,其他处理组胞浆中Cytochrome c的含量均升高(p<0.05或p<0.01),并在所有处理组中均检出胞浆中Smac/DIABLO的含量的升高(p<0.01)。(四)Caspase3,9酶活性①MEHP处理L02细胞36h,在≥25.00μM各处理组的Caspase3和9酶活性均显著性升高(p<0.05或p<0.01)。②MEHP处理HepG2细胞36h,除6.25μM处理组外,其他处理组的Caspase3和9酶活性均显著性升高(p<0.05或p<0.01)。结论:MEHP上调L02细胞和HepG2细胞pxr基因的mRNA表达水平,诱导CYP3A4蛋白表达量及其酶活性的增加；诱导p53和促凋亡蛋白(Bax、 NOXA、 PUMA)上调,以及MDM2和Bcl-2蛋白的下调,并激活了线粒体凋亡通路。第三部分Fas/FasL在p53非依赖性信号通路调控MEHP致肝细胞凋亡中的作用第二部分的研究结果显示：p53介导了线粒体通路调控MEHP致肝细胞的凋亡。目的：采用RNA干扰技术沉默p53,探索性研究p53非依赖性信号通路在MEHP致L02细胞和HepG2细胞凋亡中的调控作用。方法：MEHP设定浓度为50.00μM和100.00μM,二甲基亚砜(DMSO)为溶剂对照(终浓度≤0.1%),检测内容包括：检测细胞凋亡率、测定p53、 p-p53、 MDM2、 Bax. Bcl-2、 PUMA、 NOXA、 Fas和FasL蛋白的表达水平、胞浆中Cytochrome c和Smac/DIABLO蛋白含量、以及Caspase3,8,9酶活性。研究结果如下：(一)L02细胞和HepG2细胞p53基因沉默效率①用RNA干扰L02细胞p53基因24h后,用qRT-PCR技术检测显示：p53mRNA表达量相对于阴性对照组的表达量降低83.1%,在处理48h后,p53蛋白表达降低52.5%。②用RNA干扰HepG2细胞p53基因24h后,P53mRNA表达量相对于阴性对照组表达量降低81.4%；在处理48h后,p53蛋白表达降低52.4%。(二)细胞凋亡①MEHP处理L02细胞和L02-P53细胞36h,与各自对照组相比,细胞凋亡率均显著性升高(p<0.01)。在相同MEHP处理浓度下,L02-p53细胞凋亡率与L02细胞相比均显著性升高(p<0.01)。②MEHP处理HepG2和HepG2-p53细胞36h,与各自对照组相比,细胞凋亡率均显著性升高(p<0.01)。在相同MEHP处理浓度下,HepG2-p53细胞凋亡率与HepG2细胞相比均显著性升高p<0.01)。(三)细胞凋亡相关蛋白①MEHP处理L02细胞36h,各处理组与对照组相比,p53、p-p53、Bax、PUMA、 NOXA、Fas和FasL蛋白表达均上调p<0.01),但MDM2和Bcl-2蛋白表达均下调(p<0.01)。MEHP处理L02-p53细胞36h,各处理组与对照组相比,MDM2、Bax、PUMA、 NOXA、 Fas和FasL蛋白表达均上调(p<0.01), p53、p-p53和Bcl-2蛋白表达均下调。同一浓度MEHP处理的L02-p53细胞和L02细胞的结果比较显示：L02-p53细胞的MDM2、Fas和FasL蛋白表达均明显上调p<0.01),而p53和p-p53蛋白则明显下调(p<0.01),但未检出Bax、Bcl-2、PUMA和NOXA蛋白表达量的变化(p>0.05)。②MEHP处理HepG2细胞36h,各处理组与对照组相比,p53、p-p53、Bax、PUMA、 NOXA、Fas和FasL蛋白表达均上调p<0.01),但MDM2和Bcl-2蛋白表达均下调(p<0.01)。 MEHP处理HepG2-p53细胞36h,各处理组与对照组相比,Bax、PUMA、 NOXA、Fas和FasL蛋白表达均上调(p<0.01), Bcl-2蛋白表达均下调；未检测到p53、p-p53和MDM2蛋白表达的改变(p>0.05)。同一浓度MEHP处理HepG2-p53细胞和HepG2细胞的结果比较显示：HepG2-p53细胞的MDM2、Fas和FasL蛋白表达均明显上调p<0.01),p53和p-p53蛋白表达明显下调p<0.01),但均未检出Bax、Bcl-2、PUMA和NOXA蛋白表达量的变化(p>0.05)。(四)胞浆中Cytochrome c和Smac/DIABLO含量①MEHP处理L02细胞和L02-p53细胞36h,各处理组与各自对照组相比,胞浆中Cytochrome c含量均显著性升高p<0.01),仅在100.00μM处理组检出Smac/DIABLO蛋白表达上调(p<0.01)。②MEHP处理HepG2细胞和HePg2-P53细胞36h,各处理组与各种对照组相比,仅在100.00μM处理组检出胞浆Cytochrome c含量显著性升高p<0.01),在所有处理组检出Smac/DIABLO蛋白表达上调p<0.05或p<0.01)。(五)Caspase3,8,9酶活性MEHP处理L02细胞、HepG2细胞、L02-p53细胞和HepG2-p53细胞36h,各处理组与各自对照组相比,Caspase3,8,9酶活性均显著性升高p<0.01)。同一浓度MEHP处理L02-P53细胞和L02细胞以及HepG2-p53细胞和HepG2细胞的结果比较显示：L02-P53细胞和HepG2-p53细胞各处理组的Caspase3,8,9酶活性均诱导性升高(p<0.05或p<0.01)。结论：在MEHP致L02细胞和HepG2细胞凋亡中,p53蛋白介导的细胞信号通路并非为其唯一的调控机制,Fas/FasL通路可代偿p53介导的线粒体通路参与细胞凋亡的调控。创新点：1.发现p53介导的线粒体凋亡通路参与了MEHP致人肝细胞凋亡的调控。2.发现Fas/FasL凋亡通路可部分代偿p53介导的线粒体通路参与MEHP致人肝细胞凋亡的调控。