论文部分内容阅读
手工克隆(Handmade Cloning, HMC)技术是近年来出现的新技术,被国际克隆和胚胎学领域誉为“具有划时代意义的突破性技术进展”。本研究优化了本实验室HMC猪胚胎的技术体系,并探讨了组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(valproic acid, VPA)对手工克隆猪胚胎发育潜能的影响。取得如下研究结果：1.本实验室HMC猪胚胎技术体系的优化。(1)探讨了用0.4μg/mL脱羰秋水仙碱(decarburization colchicine, DC)处理结合3.3mg/mL链酶蛋白酶消化后恢复对去核效率的影响,其中用DC处理成熟卵母细胞60min,链酶蛋白酶消化后恢复25min,得到最高的整体去核效率76.19%,链酶蛋白酶消化后恢复25min得到的整体去核效率高于消化后恢复15min得到的整体去核效率。(2)探讨了粘合方式对融合效率的影响,去核后半卵的粘合采用卵-卵-供体、卵-供体-卵两种方式,其中以卵-供体-卵式的粘合方法得到的融合效率最高(87.17%vs74.40%)。通过体系的优化,HMC猪的囊胚率显著高于优化前的囊胚率(36.69%vs21.15%)。2.探讨了VPA处理来自不同类型供体细胞的HMC猪胚胎对其发育效果的影响。当用颗粒细胞(granular cell, GC)为核移植供体时,用50nmol/L的VPA处理HMC猪重构胚24h的囊胚发育率(48.92%±1.76)极显著高于对照组(36.87%±0.74),25nmol/LVPA (32.58%±0.96),75nmol/L (37.91%±1.24)和100nmol/L (32.27%±0.67)的重构胚(P<0.01)。当用猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)为核移植供体时,用50nmol/L VPA和75nmol/L VPA处理HMC猪重构胚24h的囊胚发育率分别为52.82%±2.50和51.41%±0.85,显著高于100nmol/L VPA处理组的囊胚发育率(45.43%±2.52,P<0.05),极显著高于对照组(36.69%±0.89)和25nmol/L VPA处理组(42.95%±2.29)的囊胚发育率(P<0.01)。(3)比较了不同浓度VPA处理以转基因的猪胎儿成纤维细胞(transgenic porcine fetal fibroblast, Tr-PFF)为供体的HMC猪重构胚24h对其发育效果的影响,结果显示100nmol/L VPA和150nmol/L VPA处理组的囊胚发育率为42.74%±1.65,38.57%±0.48,极显著高于0nmol/L,25nmol/L,50nmol/L,75nmol/L VPA处理组的32.39%±1.49,31.02%±1.81,28.69%±1.59,33.57%±1.09(P<0.01)。3.探讨了VPA处理对HMC猪重构胚组蛋白acH3K14水平的影响。试验结果表明：(1)一抗acH3K14的最佳免疫荧光染色浓度为1：100,二抗acH3K14的最佳免疫荧光染色浓度为1：200。(2)50nmol/L VPA处理24h组(HMC-V)2-cell及囊胚阶段的组蛋白acH3K14水平(1.044±0.023,1.117±0.020)极显著高于空白组胚胎(HMC)2-cell及囊胚阶段的组蛋白acH3K14水平(0.913±0.026,1.079±0.017)(P<0.01)及孤雌激活组胚胎(PA)2-cell及囊胚阶段的组蛋白acH3K14水平(0.97±0.047,1.026±0.045)(P<0.01)。 VPA处理HMC重构胚24h能提高HMC胚胎的组蛋白乙酰化水平。4.探讨了VPA处理对HMC猪重构胚的发育相关基因表达水平的影响。试验结果表明：(1)VPA处理HMC重构胚24h,可以提高HMC胚胎的HAT1基因mRNA在1-cell,2-cell及囊胚中的相对表达量(3.02±0.04,2.59±0.14,3.83±0.22),极显著高于HMC胚胎及PA胚胎在1-cell,2-cell及囊胚中的相对表达量(2.64±0.07,1.63±0.17,2.73±0.18VS1.00±0.18,1.00±0.26,1.00±0.09)(P<0.01)；极显著降低HMC-V胚胎的HADC2基因的mRNA在2-cell及囊胚中的相对表达量(0.74±0.04,0.58±0.07)(P<0.01)。(2)VPA处理HMC重构胚24h,可以提高HMC胚胎的多能性基因OCT4的mRNA在1-cell,2-cell及囊胚中的相对表达量(1.30±0.03,1.58±0.17,1.77±0.07)极显著高于PA胚胎在1-cell,2-cell及囊胚中的相对表达量(P<0.01),与HMC胚胎相比OCT4的mRNA在各阶段胚胎的表达量差异不显著；对于NANOG的mRNA的相对表达量而言,HMC-V胚胎在1-cell的mRNA的相对表达量低于PA胚胎(0.37±0.06VS1.00±0.17)(P<0.01),而在2-cell及囊胚中的相对表达量(2.46±0.12,6.15±0.12)极显著高于HMC,PA胚胎(1.51±0.09,1.73±O.05VS1.00±0.11,1.00±0.32)(P<0.01).VPA处理HMC重构胚24h,在一定程度上提高了HMC胚胎的发育潜能。