慢性胰腺炎在病理组织学上以胰腺纤维化为主要特征。建立有效的体内、外胰纤维化模型，对于研究胰纤维化的发病机制、探索新的诊断和治疗方法都有着重要意义。胰星状细胞(pancreaticstellatecell，PSC)与肝星状细胞(hepaticstellatecell，HSC)在形态学和富含VitA脂滴等特征上极为类似，因而推测PSC在胰纤维化中可能具有重要作用。PSC的活化是PSC产生大量细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)的关键，深入研究PSC活化的信号转导通路，在不同靶点进行激活、阻止或抑制其活化的研究，对于阐明以及找到减轻甚至逆转纤维化形成的有效方法将具有决定性意义。细胞因子TGF-β、PDGF等可以活化PSC，导致PSC快速增殖和大量分泌ECM。文献报道，PDGF在胰纤维化发生中可能起着关键的丝裂原作用，但该通路诱导PSC活化的分子机制、对ECM的调节作用以及信号通路的限速环节尚不十分清楚。本研究着重探讨细胞因子PDGF信号通路及中间信号分子ERK1在大鼠PSC活化和ECM产生中体内和体外的生物学效应。 第一部分蛙皮缩胆囊肽诱致大鼠胰纤维化的实验研究 目的：采用CCK类似物蛙皮缩胆囊肽反复诱致大鼠胰腺炎，旨在有效建立大鼠胰纤维化模型，以进一步探讨胰纤维化发生的分子机制。 方法：SD大鼠蛙皮缩胆囊肽50μg/kg腹腔注射，每周3次，分别于第2周、第4周和第8周处死大鼠，采用HE染色和VG胶原染色观察不同时期胰腺病理组织学变化和结缔组织增生情况。同时，采用RT-PCR法检测不同造模时期胰腺中Colα1(Ⅰ)mRNA的表达水平。 结果：造模第2周和第4周，胰腺间质中可见明显的炎性细胞侵润；第8周，“管状复合体”形成，间质纤维结缔组织大量增生并向小叶内伸展，胶原纤维交织成网状；而且随着造模时间的延长，Colα1(Ⅰ)基因的表达逐渐上调。 结论：蛙皮缩胆囊肽多次大剂量腹腔注射致反复急性胰腺炎发作可以诱导大鼠产生胰纤维化，Colα1(Ⅰ)mRNA水平随造模时间延长逐渐升高，其机制可能与细胞信号分子介导的胰星状细胞活化而发生表型转化有关。 第二部分细胞外信号调节激酶-1基因在胰纤维化大鼠胰腺中的表达 目的：探讨细胞外信号调节激酶-1(extracelluarsignalregulatedkinase-1，ERK1)介导的细胞信号通路在蛙皮缩胆囊肽诱致的大鼠胰纤维化发生机制中的可能作用。 方法：SD大鼠腹腔内每周三次反复注射50μg/kg蛙皮缩胆囊肽，建立大鼠胰纤维化模型；采用免疫组织化学染色法检测胰纤维化大鼠胰腺中ERK1蛋白的表达及分布情况，RT-PCR半定量测定不同造模时期ERK1mRNA表达水平。 结果：蛙皮缩胆囊肽造模第2周时，可见急性水肿型胰腺炎表现，大量炎性细胞侵润尤其是中性粒细胞侵润。第8周HE染色见显著胰纤维化征象。与纤维化进程相平行，胰腺组织中ERK1蛋白和ERK1mRNA亦逐渐升高。 结论：实验表明，ERK1介导的细胞信号通路在胰纤维化分子发生机制中可能具有重要作用。 第三部分大鼠胰星状细胞的体外分离培养 目的：探索一种体外分离培养胰星状细胞(PSC)的新方法，为进一步研究胰纤维化的分子发生机制打下实验基础； 方法：采用改良胰蛋白酶消化法体外分离培养PSC，同时采用胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化染色和荧光倒置显微镜观察对原代培养的PSC加以鉴定； 结果：PSC具有HSC相似的特征，细胞呈梭形或星形，细胞骨架蛋白GFAP染色阳性，由于胞质内含VitA脂滴，在荧光倒置显微镜下于328nm波长处可见自发绿色荧光； 结论：酶消化法体外分离培养PSC，方法简单、经济、易行，重复性好，为进一步研究PSC的活化与抑制的信号转导通路的分子机制提供了有用的体外模型。 第四部分血小板生长因子活化胰星状细胞的分子机制研究 目的：血小板生长因子(PDGF)是诱导胰星状细胞(PSC)活化的重要细胞因子，其分子机制尚不清楚。采用PDGF-BB诱导体外培养的PSC，旨在探讨PDGF信号转导通路在胰纤维化形成的分子发生机制中的可能作用。 方法：PSC与不同剂量PDGF-BB(10ng/mL，25ng/mL和50ng/mL)共同培养，24h后收集细胞，采用Western-blotting检测PSC中磷酸化细胞外信号调节激酶-1(pERK1)蛋白水平和RT-PCR检测Colα1(Ⅰ)mRNA的表达。 结果：不同剂量PDGF-BB作用于PSC后，各组pERK1蛋白表达比空白对照组有不同程度上调；Colα1(Ⅰ)mRNA在PSC中表达也明显上调，且在一定范围内与PDGF-BB剂量呈正相关。 结论：PDGF-BB激活PSC的作用可能是通过Ras-MAPK途径上游信号分子激活ERK1而形成活性的磷酸化ERK1即pERK1来实现，同时该途径与细胞外基质成分Ⅰ型胶原的产生有密切关系。 第五部分PD98059对血小板生长因子介导的大鼠胰星状细胞活化的影响 目的：与肝星状细胞(HSC)相类似，胰星状细胞(PSC)可能是胰纤维化发生的主要效应细胞，其活化与抑制过程是胰纤维化发生机制的关键所在。本研究采用PDGF-BB及ERK特异性抑制剂PD98059分别作用于体外培养的PSC，以探讨PDGF信号通路在PSC活化与抑制过程中的生物学效应。 方法：体外培养的PSC与25ng/mL的PDGF-BB和不同剂量的PD98059(5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL和40ng/mL)共培养，37℃，24h后收集细胞，采用Western-blotting检测各组PSC中磷酸化细胞外信号调节激酶-1(pERK1)蛋白水平和RT-PCR检测Colα1(Ⅰ)mRNA的表达。 结果：各组间pERK1蛋白表达水平有明显差异，其中PDGF-BB处理组pERK1蛋白表达显著升高，PD98059处理后各组pERK1蛋白表达明显下降，pERK1蛋白表达水平在一定范围内与PD98059剂量呈负相关，其抑制作用以20ng/mL为最佳(P＜0.01)；PDGF-BB处理组Colα1(Ⅰ)mRNA表达最高，PD98059处理后各组Colα1(Ⅰ)mRNA表达明显下降(P＜0.01)，Colα1(Ⅰ)mRNA表达结果与pERK1蛋白表达水平变化有一定相关关系。 结论：PDGF-BB可使PSC活化，活化的PSC中pERK1蛋白和Colα1(Ⅰ)mRNA表达明显上调，而ERK特异性抑制剂PD98059对PDGF-BB介导的PSC活化具有较强的抑制作用，提示ERK1在PDGF介导的PSC活化的信号通路中发挥了重要生物学效应。