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目的:在探讨神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分离培养和扩增的基础上,重点研究抗坏血酸(ascorbic acid,AA)和胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)对体外培养的NSCs定向分化为多巴胺(dopamine,DA)能神经元的影响,为DA能神经元的定向分化研究提供基础的实验依据。方法:(1)从新生24h内的SD大鼠脑组织分离NSCs,采用无血清悬浮培养法进行NSCs体外扩增培养。倒置相差显微镜观察细胞形态,通过绘制细胞生长曲线观察NSCs的自我更新和增殖能力,采用免疫细胞化学法检测NSCs标志物神经上皮干细胞蛋白(neuroepithelial stem cell protein,Nestin)的表达及分化后细胞神经元特异性烯醇化酶(neuron specialenolase,NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和2,3-环核甘酸磷酸二脂酶(cyclic nucleotide phosphohydrolase,CNP)的表达;(2)第二代NSCs诱导培养基中分别给予不同浓度的AA,10ng/mlGDNF及100μmol/1 AA+10ng/ml GDNF。10d后终止诱导,进行DA能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和多巴胺转运蛋白(dipamine transporter,DAT)的免疫细胞化学检测和TH基因的RT-PCR检测。结果:(1)从新生SD大鼠脑组织分离的细胞在无血清的培养基中形成悬浮的神经球。神经球具有自我更新和表达Nestin的能力,分化后的细胞能表达神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞的特异性抗原。(2)与对照组比较,不同浓度的AA组、10ng/ml GDNF组及100μmol/l AA+10ng/ml GDNF联合诱导组均能增加NSCs向TH阳性细胞分化的比率(p＜0.05)。与单独运用100μmol/l AA或10ng/ml GDNF组比较,100μmol/l AA+10ng/ml GDNF联合诱导组可明显提高NSCs向TH阳性细胞分化的比率(p＜0.05)。各诱导组均检测到TH mRNA的表达。结论:(1)从新生大鼠的脑组织中成功分离出NSCs,其具有在体外自我更新和增殖、多向分化潜能及表达Nestin的能力。(2)在本实验中,不同浓度AA组均能促进NSCs向DA能神经元分化。(3)GDNF能促进NSCs向DA能神经元分化,与AA联合诱导后分化作用得到进一步加强。