研究目的： 青蒿素（Artemisinin）最初是由我国学者从菊科植物黄花蒿（Artemisiaannua Linn）叶中提取分离到的具有过氧化基团的倍半萜内脂类化合物，青蒿琥酯（artesunate）、蒿甲醚（artemether）和二氢青蒿素（dihydroartemisinin）等均为青蒿素的衍生物。这类药物具有显著的抗疟疾、抗血吸虫、抗弓形虫等药理作用。目前青蒿素及其衍生物在临床上广泛应用于抗疟治疗，是抗疟特效药。近年研究发现青蒿素及其衍生物还具有明确的体内外抗肿瘤活性。其药理研究和临床验证受到了广泛关注。青蒿素及其衍生物以其独特的抗肿瘤机制，可以选择性地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞作用很小，目前尚未发现与传统化疗药物存在交叉耐药，而且能通过抑制谷胱甘肽-s-转移酶的活性，逆转肿瘤细胞的多药耐药，与传统化疗药物同时应用可起到协同、增效的作用。二氢青蒿素（dihydroartemisinin）是青蒿素类药物在体内的主要活性代谢产物，与其他青蒿素类衍生物相比具有更强的抗肿瘤活性，但其作用机制尚不够明确。本研究以乳腺癌细胞系T47D为研究对象，通过观察DHA对T47D细胞增殖，细胞周期，细胞凋亡的影响以及对胞内凋亡调控因子基因和蛋白的影响，初步探讨其诱导凋亡相关的分子机制，为DHA的临床治疗提供实验和理论依据。 研究方法： 1．采用MTT检测法细胞增殖抑制实验观察二氢青蒿素对乳腺癌细胞T47D的增殖动力学的影响，DHA浓度设5、10、20、40、60、80、100umol/l共7组，分别培养24h，48h和72h，计算各实验点的增值抑制率，用SPSS13软件计算药物的50％抑制浓度（IC50值）。抑制率％=（1-药物组A值/细胞对照组A值）×100％ 2．流式细胞术分析药物作用前后乳腺癌细胞T47D细胞周期的分布情况，根据MTT结果筛选合适的药物浓度和作用时间进行分组，DHA浓度设20、40、60umol/l共3组，培养48h，加入DNA染液（PI50mg/L、RNA酶10ug/mL及1％Triton-X100）500μl避光染色30min后，300目筛网过滤后上机检测。同样实验重复3次。用随机软件分析细胞周期。 3．AnnexinⅤ-PI双染法检测药物作用前后乳腺癌细胞T47D早期凋亡细胞比例收集48h药物浓度20、40、60umol/L组及DMSO对照组的细胞，加入FITC标记的Annexin-Ⅴ（20mg/L）20μl和PI（20mg/L）20μl避光双染后，流式细胞术检测。同样实验重复3次。 4．逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测药物作用前后乳腺癌细胞T47D胞内凋亡调控因子Bim基因mRNA水平的改变，DHA浓度设20、40、60umol/l共3组，培养48h，提取总RNA，紫外分光光度计测定OD260/OD280比值，以估算RNA样品的浓度及纯度。逆转录反应结束后，琼脂糖凝胶电泳，美国Kodak凝胶成像系统成像，1DImageAnalysisSoftware软件分析各条带灰度，以与β-actin的相对比值比较mRNA表达水平。 5．蛋白质印迹技术（Westernblot）检测药物作用前后乳腺癌细胞T47D胞内凋亡调控因子蛋白tbid，caspase8表达的变化，DHA浓度设20、40、60umol/l共3组，培养48h，收集细胞裂解，裂解液SDS-PAGE电泳后，转膜，封闭，抗体孵育，于LAS4000mini化学发光分析仪中显影。蛋白表达水平以各组积分光密度值与actin积分光密度值比值表示。 实验结果： 1．不同浓度的DHA作用于T47D细胞24h、48h、72h后，DMSO溶剂对照组与相应时间的细胞对照组的A值相比无显著差异（P>0．05），各浓度组与相应时间DMSO溶剂对照组A值差异均有统计学意义（P<0．01）；经相关性分析，药物对T47D细胞的抑制率呈浓度（10，20，40，60，80，100μmol/L）依赖性升高（r=0．911，P<0．01），亦呈时间（24h，48h，72h）依赖性升高（r=0．918，P<0．01），DHA作用24，48，72h的IC50值分别为60．03，33．86，17．18μmol/L。 2．20，40，60μmol/LDHA作用于乳腺癌细胞48h后，与对照组相比，呈剂量依赖性改变细胞周期的分布，G0/G1期细胞比率上升，S期细胞比率下降，细胞增殖受阻在G0/G1期。 3．DHA作用48h后20、40、60μmol/L浓度组乳腺癌细胞T47D的早期凋亡率分别为（20．81±0．68）％，（30．90±0．73）％，（45．32±2．17）％（n=3），各浓度与对照组（0．98±0．08）％相比差异显著（均为P=0．000）；且随药物浓度的增高而升高，差异有统计学意义。（one-wayANOVA；F=53．1，P=0．000） 4．RT-MR检测BimmRNA水平的改变，结果显示，对照组和实验组均表达Bim基因，实验组高于对照组。其中60umol/LDHA组BimmRNA表达量明显高于对照组5．WesternBlot检测凋亡相关蛋白tbid，caspase8的表达，20、40、60μmol/L的DHA作用于乳腺癌细胞48h后，凋亡相关蛋白tbid，caspase8的表达强度与对照组相比差异显著（均为P<0．05）；且随DHA浓度的增高而增强，差异有统计学意义。 结论： 1．DHA能显著抑制人乳腺癌细胞T47D生长，而且抑制率呈浓度和时间依赖性升高；DHA呈剂量依赖性改变T47D细胞周期的分布，G0/G1期细胞比率上升，S期细胞比率下降，细胞增殖受阻在G0/G1期，从而抑制肿瘤的生长。 2．DHA能诱导人乳腺癌T47D细胞凋亡，其早期凋亡率随着药物浓度的增高而升高。 3．DHA作用于人乳腺癌细胞T47D后促使BimmRNA表达增强，同时促使tbid，caspase8蛋白表达增强，因此DHA诱导T47D凋亡的分子机制可能是DHA激活了凋亡的死亡受体通路和线粒体通路。