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精子的超低温冷冻保存技术是辅助生殖技术以及精子库的重要组成部分,此技术水平的提高以及复苏率的稳定性都直接影响着最终受孕率。然而精子经冷冻复苏后,其存活率、活力、DNA完整性、质膜蛋白组成以及线粒体基质密度等都发生了不同程度的损伤,并且其宫颈黏液穿透力、穿卵能力等生育力也显著降低。精子糖萼,又称糖被,是睾丸生成的精子在附睾成熟过程中,附睾上皮细胞产生的各种糖基化修饰的蛋白或脂质结合到精子膜表面而形成的,是雄性配子与外界环境相互作用的主要界面,在精子保存、精子穿透宫颈黏液以及精子与卵子的识别和结合过程中具有重要作用。精子糖萼损伤可能导致生育力降低甚至不育。然而由于精子糖萼结构复杂,以往的研究缺乏高通量、简便的分析手段,关于人精子经超低温冷冻后其表面糖萼的变化情况目前尚未报道。本文通过比较三种精子冷冻液,自配的以及商业化的Quinn和ORIGIO,对精子冷冻复苏率的影响,发现ORIGK)精子冷冻保护液的复苏效果最好;在此基础上,我们又进一步比较了人工降温法、程序降温法,以及一步熏蒸法三种冷冻方法对精子复苏率的影响,发现一步熏蒸法效果最佳。通过比较优化,我们选择了 ORIGIO精子冷冻保护液,以及一步熏蒸法进行后续研究超低温冷冻对精子糖萼的影响。本课题利用本实验室已建立的凝集素芯片检测人精子糖萼的技术,通过比较超低温冷冻前后人精子与凝集素结合谱,发现35种凝集素在精子冷冻复苏后具有显著性差异,其中与9种凝集素的结合显著增加,26种显著降低。我们选择了其中4种与精子结合增加的凝集素(ABA、AIA、UEAI和PSA)和2种与精子结合降低的凝集素(MAA和DSL),通过流式细胞仪验证,发现与精子结合增加的ABA、AIA和PSA以及与精子结合降低的MAA与芯片结果一致。这些凝集素未来可用于评价精子冷冻保护液或精子冷冻方法的优劣,为人类精子库或辅助生殖中心精子的冷冻条件的优化提供新的评价方法。另一方面,我们还通过比较耐冻组和不耐冻组精子与凝集素结合的差异,发现耐冻组精子样本与ABA的结合显著降低;通过大样本验证,与芯片结果完全一致,未来ABA可作为评价精子耐冻性能的潜在生物学标志物,为临床夫精冷冻及冷冻后精子质量评价提供新的评价指标。