心血管疾病是一种严重危害人类健康的疾病,其中,动脉粥样硬化已经成为西方发达国家引起死亡的主要病因,其发病率和病死率均为各项疾病之首,在中国的发病率和死亡率亦逐年上升。在他汀等一线抗动脉粥样硬化治疗药物存在一些不良反应,应用受到一定限制的情况下,从天然植物或中草药中挖掘能够阻滞、延缓动脉粥样硬化病变进程的药物,对动脉粥样硬化的防治工作具有非常重要的科学意义和社会价值。二氢杨梅素是一种二氢黄酮醇类黄酮化合物,广泛存在于葡萄科蛇葡萄属植物中,在中药藤茶的原植物显齿蛇葡萄幼嫩茎叶中含量可达30%。《中华本草》记载,藤茶有“清热利湿,平肝降压,活血通络”的功效。既往研究发现,二氢杨梅素具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降血压、抑制体内血栓形成、降糖、保肝和防止病原微生物等药理活性,然而关于其预防和治疗动脉粥样硬化的功效机制尚无报道。本研究从动脉粥样硬化目前公认的两个主要的病因学说出发,考察二氢杨梅素对动脉粥样硬化病变过程中内皮细胞损伤的保护作用以及对炎症反应的影响,并探究其可能的作用机制。同时,采用网络药理学的分析方法,对二氢杨梅素在动脉粥样硬化以及其他一些疾病中的蛋白靶点进行预测和分析。第一章二氢杨梅素对过氧化氢诱导的内皮细胞损伤的保护作用研究目的：体外考察二氢杨梅素对过氧化氢诱导的内皮细胞损伤的保护作用。方法：体外培养人脐静脉内皮细胞,用过氧化氢诱导建立氧化损伤模型,检测二氢杨梅素对内皮细胞活力的影响；用不同浓度的二氢杨梅素干预,检测抗氧化酶SOD以及过氧化产物MDA含量的变化；通过流式细胞术检测二氢杨梅素对过氧化氢引起的细胞凋亡的影响,并用Hoechst33342染色确认结果；用荧光显微镜观察细胞ROS释放的变化；用试剂盒检测NO的释放情况。结果：在0到300μM的浓度范围内,二氢杨梅素能够增加内皮细胞的活性,能够有效减少过氧化氢诱导的HUVECs的MDA的产生,但对SOD的活性无明显影响。流式细胞实验结果说明,二氢杨梅素能够剂量依赖性的降低过氧化氢诱导的HUVECs细胞的凋亡比率,发挥细胞保护作用。Horchst3334染色实验发现,经二氢杨梅素预处理后,过氧化氢引起的细胞凋亡逐渐减少。荧光显微镜检测ROS的释放结果说明,二氢杨梅素能够减少过氧化氢诱导的内皮细胞ROS的过量产生。另外,在过氧化氢诱导的内皮细胞损伤模型中,二氢杨梅素预处理2h能够明显增加受损伤内皮细胞NO的释放量。结论：二氢杨梅素能够减少过氧化氢诱导的内皮细胞损伤或凋亡,提示二氢杨梅素可从阻滞动脉粥样硬化的起始环节-内皮细胞的损伤来预防或延缓动脉粥样硬化的病变进程。第二章二氢杨梅素对过氧化氢诱导的内皮细胞损伤的保护机制研究目的：探讨二氢杨梅素产生内皮细胞保护作用可能的机制。方法：体外培养人脐静脉内皮细胞,用过氧化氢诱导建立氧化损伤模型,用不同浓度的二氢杨梅素预处理,检测二氢杨梅素对凋亡信号通路Bax、Bcl-2、p53、p-p53、cytochrome c、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、PARP和cleaved PARP等信号分子的影响。结果：二氢杨梅素能够通过抑制过氧化氢诱导的p53的激活,之后增加Bcl-2的表达,减少Bax的表达,进而抑制线粒体cytochrome c的释放,抑制caspase-3的激活,减少PARP的裂解,发挥内皮细胞保护作用。结论：二氢杨梅素的内皮细胞保护作用,可通过抑制过氧化氢诱导的线粒体凋亡信号通路来实现。第三章二氢杨梅素体内外抗炎作用研究目的：体内外实验考察二氢杨梅素的抗炎作用。方法：建立LPS诱导的小鼠急性炎症模型,检测二氢杨梅素对小鼠血清中不同炎症因子水平的影响；建立TPA诱导的小鼠急性耳肿胀模型,检测二氢杨梅素对小鼠耳肿胀的影响；建立LPS诱导的Raw264.7巨噬细胞模型,检测二氢杨梅素对细胞不同炎症因子释放的影响。结果：在LPS诱导的小鼠急性炎症中,与模型组相比,高浓度的二氢杨梅素能够明显抑制小鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平,显著增加小鼠血清抗炎因子IL-10的水平。在LPS诱导的Raw264.7巨噬细胞模型中,二氢杨梅素同样能够明显抑制LPS诱导的Raw264.7巨噬细胞促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6因子的释放,显著增加巨噬细胞抗炎因子IL-10的释放。在TPA诱导的小鼠急性耳肿胀模型中,二氢杨梅素能够明显降低小鼠的耳肿胀程度。结论：体内外实验的研究结果显示,二氢杨梅素具有较好的抗炎作用。在动脉粥样硬化中,巨噬细胞分泌的一些炎症介质能够最终导致斑块的形成。因此本研究说明,二氢杨梅素具有潜在的抗动脉粥样硬化作用。第四章二氢杨梅素抗炎作用机制研究目的：探讨二氢杨梅素产生抗炎作用可能的信号通路机制。方法：建立LPS诱导的Raw264.7巨噬细胞炎症模型,用不同浓度的二氢杨梅素干预,检测细胞中iNOS, TNF-a和COX-2的蛋白表达,以及LPS诱导的炎症信号通路关键信号分子p-NF-κBp65、IκBα、p-IκBα、p38、p-p38、ERKl/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK等的蛋白表达,阐明二氢杨梅素抗炎作用机制。结果：与模型组相比,二氢杨梅素能够剂量依赖性的降低Raw264.7巨噬细胞的iNOS、COX-2和TNF-α的蛋白表达水平；降低NF-κB p65和IκBa磷酸化水平,降低MAPKs家族成员JNK和p38的磷酸化水平,但对ERK1/2的磷酸化水平无明显影响。结论：二氢杨梅素可能通过抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中p38和JNK的磷酸化,以及NF-κB的活化,进而抑制炎症介质的释放和相关酶的蛋白表达来实现其抗炎作用。第五章基于网络药理学的二氢杨梅素作用靶点预测研究目的：预测二氢杨梅素在动脉粥样硬化及其他一些疾病中可能的蛋白靶点,并结合己有的文献报道进行分析。方法：采用网络药理学的方法,在PubChem中搜索与二氢杨梅素结构相似性高于95%的化合物,根据这些化合物对应的蛋白靶点预测二氢杨梅素可能具有的药理作用蛋白靶点。结果：基于在PubChem中的寻靶结果,结合藤茶和二氢杨梅素的相关药理作用报道,我们认为二氢杨梅素很可能会对动脉粥样硬化中基质金属蛋白酶-9、谷胱甘肽S转移酶、热休克蛋白B等蛋白靶点产生作用。另外,推测二氢杨梅素的降糖作用可能与抑制糖原磷酸化酶的活性有关。藤茶治疗黄疽型肝炎的功效,可能与其与对碱性磷酸酶的影响有关。结论：网络药理学中的靶点预测分析能为二氢杨梅素下一步的动脉粥样硬化研究带来启示,也能在一定程度上预测二氢杨梅素在其他一些疾病中的蛋白靶点。