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马蔺(Iris lactea)又名马莲,是鸢尾科鸢尾属多年生的宿根草本植物,广泛分布于全国各地。其根系十分发达、长势旺盛、对环境适应性强是耐重金属、抗旱、耐盐碱的优良观赏地被植物。本研究以马蔺为研究材料,拟采用RACE技术获得HMA2全长cDNA序列;利用原子吸收分光光度计和Real-time RT-PCR技术分别对不同浓度CdC12· 2.5H2O处理下其根及地上部的HMA2表达水平及Cd2+积累模式与变化规律进行分析;揭示其在低镉(25 mg L-1 CdC12·2.5H20)或高镉(150 mg L-1 CdC12.2.5H2O)处理不同时间(0-168 h)下马蔺IlHMA2表达模式时空变化规律。以马蔺根中总RNA为模板,采用RT-PCR方法获得了重金属ATP酶基因片段,以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,采用酶切和连接的方法,构建了 CaMV35S启动子驱动含有目的基因IlHMA2片段的反向重复序列表达载体pARTG1G2,并使用农杆菌介导将此重组质粒整合入农杆菌GV3101,并转入到马蔺幼苗体内获得了I万HMA2-RNAi转化株系。研究结果将为阐明IlHMA2介导的Cd2+长距离运输在马蔺适应重金属镉污染环境中的作用机制奠定基础。具体研究结果如下:(1)成功从马蔺中克隆到HMA2基因,该基因全长cDNA为 3538 bp,包含2829bp的开放阅读框(ORF),29 bp的5’非翻译区(UTR)和680 bp的(UTR)。编码942个氨基酸,推测分子量为101.5 kDa,等电点为8.12,且与其它植物HMA2氨基酸的序列同源性达60%以上。将马蔺IlHMA蛋白的氨基酸序列与GenBank中的核苷酸序列进行比对,结果显示马蔺IlHMA与小麦、水稻和拟南芥植物的HMA2蛋白同源性分别为68%、66%和55%;IlHMA具有8个跨膜区,且含有重金属P1B-ATPase酶特有的GICCPSE、CPC、DKTGT、HP及GDGMNDAPAL基序,故属于重金属家族。(2)马蔺幼苗在不同浓度CdC12·2.5H20处理下,HMA2主要在根中表达呈递增趋势,且随着CdC12·2.5H20(5-150mg/L)处理浓度的增加,HMA2在其叶片转录丰度呈递减趋势,表明根中的IlHMA2表达水平出现显著高于地上部。在(25 mg.L-1 CdC12·2.5H20)和高镉(150mg·L-1 CdC12.2.5H20)处理下,随着处理时间(3-168h)的延长马蔺地上部和根中的IlHMA2表达水平呈增加趋势,根中的IlHMA2表达水平均高于地上部,而地上部的IlHMA2表达水平没有显著变化;然而低镉处理下地上部的IlHMA2表达水平是高镉处理的3.6-2.4倍,而高镉处理下根中的IlHMA2表达水平是低镉处理的3.4-3.3倍。可见,IlHMA2的表达受镉胁迫的诱导及调节。(3)成功构建了植物表达载体pART27G1G2,通过农杆菌介导的注射法将RNAi整合到马蔺基因组中,用PCR方法筛选获得了转化植株To代,马蔺阳性植株转化率达5%,说明此转化方法适合于单子叶植物。(4)将获得的马蔺IlHMA2-RNAi转化植株以分株的方式进行无性繁殖。研究发现,IlHMA2基因主要在根中表达,并受镉胁迫的诱导和调节。据此,我们将筛选出来的各IlHMA2-RNAi转化植株用100 mg L-1 CdCl2· 2.5H20处理48 h,提取它们的根部总RNA,并通过了半定量RT-PCR的方法对其基因沉默的效果进行分析。实验发现,与野生型相比,各IlIHMA2-RNAi转化株系的表达丰度均有不同程度的下调,其中L1号的IlHMA2表达丰度下调幅度最小,为30%、而L9号与L12号表达丰度下调幅度最大,分别为88%和76%,说明RNA干扰对靶基因具有较好的沉默效果。因此,下一步选择L1号、L9号与L12号植株进行各组织中Cd2+、Zn2+含量,MDA含量,相对电导率,叶绿素含量,光合速率等生理指标的测定,进而揭示IlHMA2在马蔺Cd2+转运中的作用,这将解析IlHMA2介导的Cd2+长距离运输在马蔺适应镉污染环境中的作用机制奠定基础。