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目的:通过对Vogt-小柳原田综合征(Vogt-Koyanagi-Harada syndrome,VKH)患者急性发作期、炎症缓解期、炎症静止期和正常对照组血浆来源的外泌体进行micro RNA芯片分析,评估四组血浆来源的外泌体中miRNA表达谱的差异,筛选出在急性发作期差异表达的miRNAs,通过对差异表达的miRNAs进行靶基因预测、基因注释和通路分析,寻找辅助诊断VKH,且能在一定程度上反应疾病炎症状态的miRNA标志物,并进一步探索VKH患者血浆来源的外泌体对自体CD4~+T淋巴细胞增殖实验的影响。方法:1.收集VKH患者急性发作期、炎症缓解期、炎症静止期和正常对照组的血浆,利用超速离心法分离获得外泌体和微囊泡(Microvesicles,MVs),透射电子显微镜观察外泌体和MVs的形态,纳米粒度分析仪检测外泌体的粒子直径分布情况,免疫印迹法检测外泌体表面蛋白标志物。2.对VKH患者急性发作期、炎症缓解期、炎症静止期和正常对照组血浆来源的外泌体进行miRNA芯片分析,检测四组血浆来源的外泌体样本中miRNAs的表达情况,筛选出差异表达的miRNAs,并对差异表达的miRNAs进行靶基因预测、基因注释和通路分析。3.用实时荧光定量PCR的方法验证差异表达的miRNAs在四组血浆来源外泌体样本中的表达水平,同时在血浆、MVs中检测miRNAs的表达水平。4.用密度梯度离心法获得人外周血单核淋巴细胞,用磁珠分选的方法获得CD4~+T淋巴细胞,用CD3和CD28单克隆抗体刺激CD4~+T淋巴细胞活化增殖,分别将VKH患者、其他类型葡萄膜炎患者和正常人血浆来源的外泌体与VKH自体CD4~+T淋巴细胞共孵育,评估其对T细胞增殖实验的影响。结果:1.用超速离心法获得血浆来源的外泌体和MVs,透射电子显微镜观察外泌体直径约为30-150 nm,中心含有低电子密度成分,由圆形或椭圆形的膜性囊泡结构所包裹;透射电子显微镜下观察MVs的直径在200-1000 nm之间,大小不等,有完整的包膜结构。免疫印迹法检测外泌体表面蛋白质标志,可见外泌体可以同时表达CD9和CD63。纳米粒度分析仪检测外泌体的粒子直径集中分布范围是30-150 nm。2.Mi RNA芯片分析共检测出870种miRNAs,其中有395种为Exocarta数据库中已知的miRNAs。根据疾病的状态筛选出差异表达的miRNAs并进行分析,有32种miRNAs在急性发作期表达水平明显增加(倍数变化大于2),炎症缓解期表达减少,炎症静止期与正常对照组无明显差异;有28种miRNAs在急性发作期表达水平显著减少。通过基因注释和通路分析,这些差异表达的miRNAs主要集中在内吞作用、肿瘤相关通路、MAPK信号通路、Wnt信号通路、Ras信号通路和T细胞受体信号通路等。3.实时荧光定量PCR的验证结果显示,VKH急性发作期血浆来源的外泌体中hsa-miR-423-3p的表达水平明显高于正常对照组,在炎症缓解期和炎症静止期有所下降,和miRNA基因芯片分析的结果是一致的,且具有统计学意义,而hsa-miR-423-3p在血浆和MVs中各组的表达水平无明显差异。4.与正常对照组相比,Vogt-小柳原田综合征急性发作期患者血浆来源的外泌体能够使自体CD4~+T淋巴细胞的增殖能力下降。结论:1.MiRNA芯片分析结果表明,Vogt-小柳原田综合征患者不同疾病状态时血浆来源外泌体中miRNA表达谱确实存在差异。2.血浆来源的外泌体中hsa-miR-423-3p的表达水平可以作为辅助诊断VKH的无创的生物标志物,并在一定程度上反应疾病的炎症状态。3.VKH急性发作期患者血浆来源的外泌体可以抑制自体CD4~+T淋巴细胞的增殖,为探索疾病治疗提供新的思路。