利用分枝杆菌等微生物以甾醇为原料,转化生产甾体医药中间体雄甾烯酮,是当下甾体医药工业体系的一条重要工艺路线。雄甾烯酮是雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)、雄甾-1,4-二烯-3,17-二(ADD)和9α-羟基AD (9α-OHAD)等系列化合物的总称,几乎可用于合成所有临床用甾体药物。然而由于该工艺路线技术门槛高,目前仅有辉瑞等个别制药公司可用于大规模工业化生产。众多研究表明：底物甾醇水溶性低、传质差、底物毒害、产物抑制以及产物降解等问题,是影响该工艺路线推广应用的重要瓶颈。基于此,本论文通过反应工艺设计、菌种进化和基因工程等手段,着力于提高菌株对高浓度底物耐受性、增加底物甾醇溶解性和传质效率等研究。我们通过开展对产物的原位吸附分离,筛选底物耐受性菌株和转化促进剂,并尝试在基因水平上强化菌株对底物转运能力等工作,来提高分枝杆菌对甾醇转化的生产效率。1、大孔吸附树脂对转化反应的促进作用针对产物抑制和后期降解,我们期望通过大孔吸附树脂对产物的原位吸附作用,来缓解产物抑制和产物降解,提高转化效率和产物得率。我们选择了XAD-7型树脂进行相关实验,结果表明：树脂的添加在解除产物抑制、降低产物降解以及缓解高浓度底物毒害上均有良好表现,产物AD、9α-OHAD的产量有显著提高,在摇瓶水平上,菌株R10的产物AD最高积累量可从0.493g/l提高至1.599g/l,菌株HK86的产物9α-OH AD可从2.069g/l提高到4.478g/l以上；7L发酵罐放大实验表明,在流加底物的情况下,20g/l的甾醇投料,产物积累量最高能达到7.559g/l。在对树脂添加的优化分析中,我们发现最佳的树脂添加量是饱和吸附量,树脂的添加时间上是48-72小时,最佳树脂解析液是乙酸乙酯,而从工业实用性上考虑,乙醇可作为优良的替代溶剂,这样可大大提高工艺的安全性、降低生产和投资成本。此外,基于更为经济的成本考虑,我们还遴选到了性能优良、价格低廉的国产树脂HZ807代替XAD-7树脂。2、甾体转运系统的强化分枝杆菌等微生物对甾醇的摄取是通过甾醇晶体颗粒与细胞壁紧密接触实现的,现已发现甾醇转化微生物具有甾体主动转运系统,即Mce4系统。提高该系统的活性,在机理上,将有助于提高微生物对底物甾醇的转化效率。分析发现：在Mce4基因簇中,包括两个并行的甾体转运系统,针对sup4A和B编码系统,我们尝试提高sup4A/B的基因拷贝数实现相应系统转运功能的强化,但最终效果并不显著。我们推测sup4A/B基因可能与其它一些蛋白以蛋白复合体的形式在Mce4甾醇转运系统中起作用的,故系统中某个基因的单一强化难以达到对整个转运系统功能的显著强化。这部分工作有待进一步深入研究。3、耐受高浓度底物的菌株筛选高浓度甾醇投料对菌株的转化能力有显著的抑制效应,即底物浓度超过最佳投料浓度后,底物浓度与产物积累量成反比。鉴于此,我们通过自适应进化这一手段,不间断地采用高浓度底物培养驯化菌株HK86和R10,筛选出可耐受高浓度甾醇的优良菌株。从上千株潜力菌株中,我们最终筛选出了耐受高浓度甾醇的AD生产菌株R10-Kal和R10-Ka2以及9a-OHAD生产菌株HK86-Kal和HK86-Ka2。在摇瓶水平上,10g/L甾醇投料浓度下,它们的转化能力有显著提升,AD的产量提升到2倍左右,而9a-OHAD的产量能提升到3倍左右。4、转化促进剂的筛选甾体为一类非极性化合物,在水中的溶解度极低,这严重制约了菌株对甾体底物的摄取利用。基于此,我们对多种硅油和PPG2000等转化促进剂进行了筛选,结果表明：聚醚改性硅油和PPG2000的添加能有效改善菌体的转化能力,产物的积累量大幅提高,分别提高到了原来产量的200%和300%左右。同时,我们对各种硅油的添加浓度和添加方式进行了优化,结果表明,最佳转化促进剂是5%的聚醚改性硅油,在转化开始时添加效果最好。5、分枝杆菌无标记基因敲除工具的构建在对Mce4甾体转运系统进行基因强化的研究中,我们发现单一地对sup4A/B基因进行强化,难以达到实验预期。我们计划借助于基因敲除对Mce4基因簇的各个基因进行更为系统、细致的功能分析,以便进行更为有效的强化。然而传统的基因敲除手段,对于多基因的基因簇分析难以胜任,因而我们进行了新的分枝杆菌无标记基因敲除工具的构建。新构建的基因敲除工具,具有对基因多次重复敲除、高效、简便等优点,能胜任对多基因的基因簇的系统分析。本论文紧扣影响菌体转化水平的三个限制性关键因素---高浓度底物甾醇毒害、产物抑制和产物降解,以此入手同时展开推进,加以解决提高菌体的代谢转化水平。树脂的引入较好地解决了产物抑制和降解的问题；而在高浓度底物毒害上,筛选获得的底物耐受性菌株和转化促进剂---聚醚改性硅油,也取得了很好的进展,但在甾醇转运系统的强化上比较局限,有待于借助新构建的基因敲除工具加以系统分析,进一步完善。