第一部分血清microRNA-182在胶质瘤患者中的表达及其临床应用价值研究研究背景胶质瘤是人类最常见的颅内恶性肿瘤之一,约占中枢神经系统肿瘤的60%,是肿瘤治疗领域五大难以治愈的肿瘤之一。因其具有难治性、易局部播散和易复发等特点,导致预后不佳。近年来出现了包括手术治疗、放疗、化疗及生物免疫治疗在内的综合治疗模式,但胶质瘤的治疗效果依然很差,5年生存率仅为约5%。导致预后差的主要原因之一为早期诊断困难,胶质瘤在被确诊时往往已经对周围脑组织产生了浸润转移。胶质瘤诊断的“金标准”仍然是组织学病理活检,然而由于它的发生多处于位置深在的颅内重要部位,病理活检手术创伤较大,患者及家属常难以接受,导致早期获取有效的病理学标本存在很大障碍。因此寻找一种新的、具有较高敏感度和特异度的生物标志物对其进行早期诊断就变得尤为重要。microRNAs (miRNAs)是一类非编码小分子RNA,通过对其靶mRNA的调控发挥作用。越来越多的研究表明miRNAs在细胞的增殖、分化、凋亡及肿瘤的发生等多种生物学行为中具有重要作用。研究显示miRNAs在多种恶性肿瘤中异常表达,且根据肿瘤类型的不同,其表达谱也不同。研究还发现miRNAs可以作为多种癌症的一种早期诊断和预后评估的生物标志物。最近研究者也在开始研究异常表达的miRNAs用于胶质瘤早期诊断和预后评估的可行性,如microRNA-205, microRNA-128和microRNA-210,然而其敏感性和特异性均难满足临床需要。microRNA-182 (miR-182)具有高度的进化保守性,位于人类的第7号染色体上(7q32.2),其过度表达已被证实可促进肿瘤的生长、浸润或影响这些肿瘤的化疗敏感性。研究发现胶质瘤肿瘤组织中miR-182表达明显上调,与不良预后和治疗效果不佳密切相关。这也提示miR-182可能成为胶质瘤早期诊断和预后评估的一个潜在的生物标志物。而相对于肿瘤组织,血清是一个更加容易获取的检测样本,对患者创伤更小,更易被患者接受。目前已经证实miR-182可在多种恶性肿瘤患者的血清中被稳定的检测到,然而miR-182在胶质瘤患者血清中的表达情况及其与临床病理特点的关系尚不清楚。本课题组在结合国内外研究的基础上,通过实时定量PCR (qRT-PCR)方法检测血清miR-182在胶质瘤患者中表达情况,并结合患者的性别、年龄、肿瘤的大小、KPS评分和WHO病理分级、短期总生存率和无病生存率等多项临床数据和特征,对其在胶质瘤临床早期诊断和预后评估中的价值进行评估。研究目的1.检测miR-182在胶质瘤患者血清中的表达水平。2.分析血清miR-182表达水平与胶质瘤患者临床特征之间的关系。3.评估血清miR-182表达水平在胶质瘤患者早期诊断中的价值。4.研究血清miR-182表达水平对胶质瘤患者预后评估的意义。研究方法1. qRT-PCR方法检测112例恶性胶质瘤患者与54例健康对照者的血清miR-182表达水平。比较胶质瘤患者与健康对照者及不同病理级别胶质瘤患者之间的血清miR-182表达水平差异。2.评估血清miR-182表达水平与胶质瘤患者各项临床特点的相关性,主要包括：性别、年龄、肿瘤的大小、KPS评分和WHO病理分级。3.分析不同组别的胶质瘤患者血清miR-182表达水平的差异。ROC曲线下面积(AUC)及ROC曲线评估血清miR-182的早期诊断价值。4.随访全部患者,分析血清miR-182表达水平与胶质瘤患者的总生存率的无病生存期(DFS)和总生存期(OS)的关联性。采用Kaplan-Meier分析评估血清miR-182对胶质瘤患者预后的预测价值。随后运用单变量和多变量Cox回归分析法以确定血清miR-182表达水平是否是胶质瘤患者预后的独立因素,探讨血清miR-182表达水平对胶质瘤患者预后评估的价值。研究结果1.miR-182在胶质瘤患者血清中的表达水平分析结果表明血清miR-182表达水平在胶质瘤患者组(mean±SD,2.57±1.95)明显高于健康对照组(0.97±0.38)(P<0.001)。在WHO Ⅳ级的胶质瘤患者血清中,miR-182表达水平明显高于WHO Ⅰ级(P<0.001)、WHO Ⅱ级(P<0.001)和WHOⅢ级(P<0.05)的患者。同时WHO Ⅳ级的胶质瘤患者血清miR-182表达水平明显高于WHO Ⅰ级(P<0.05)的胶质瘤患者。2.血清miR-182表达水平与胶质瘤患者临床特点的相关性血清miR-182表达水平与胶质瘤患者KPS评分(P=0.025)和WHO病理分级((r=0.786,P=0.006)密切相关。而与胶质瘤患者性别、年龄、肿瘤的大小无统计学相关性(均P>0.05)。3.血清miR-182表达水平对胶质瘤患者的早期诊断价值研究结果发现高级别胶质瘤患者组血清miR-182表达水平(3.25±2.05)明显高于低级别胶质瘤患者组(1.38±0.94)和健康对照组(0.97±0.38)(均P<0.001),但在低级别胶质瘤患者组和健康对照组之间无显著性差异;P>0.05)。 ROC曲线显示AUC为0.778(95%CI,0.679-0.878),临界值为1.56,相应的敏感度和特异度分别为58.5%和85.2%。血清miR-182水平对高级别胶质瘤的早期诊断价值分析,AUC为0.815(95%CI,0.718-0.913)。对低级别胶质瘤的早期诊断性能分析,AUC为0.621(95%CI,0.500-0.741),显著低于全部的胶质瘤或高级别胶质瘤(均P<0.05)。4.血清miR-182表达水平与脑胶质瘤患者预后评估的相关性分析血清miR-182高水平表达组的累计5年总生存率的无病生存期(DFS)和总生存期(OS)较血清miR-182低水平表达组短,其中高水平表达患者组DFS (32.786,95%CI:22.941-33.059)与低水平表达患者组DFS (44.923,95%CI: 31.487-58.513)比较有显著差异(P=0.006)；高水平表达患者组OS (19.325, 95%CI:9.620-20.380)与低水平表达患者OS (30.638,95%CI:24.668-39.332)比较有显著差异(P=0.003)。单变量Cox比例风险回归模型分析显示,DFS和KPS评分显著相关(P<0.001),同时也与患者的WHO病理分级(P<0.001)和血清miR-182表达水平(P=0.009)显著相关。同时结果显示OS也和KPS评分(P<0.001)、WHO病理分级(P<0.001)以及血清miR-182表达水平(P=0.004)显著相关。多变量Cox回归分析表明血清miR-182表达水平为DFS (P=0.034)和OS(P=0.013)的独立预后因素,而KPS评分及WHO病理分级也均为DFS和OS的独立预后因素。结论1.血清miR-182表达水平在胶质瘤患者中明显升高,且与脑胶质瘤患者WHO病理分级密切相关。2.血清miR-182对胶质瘤有一定的早期诊断价值,有可能成为一种潜在的肿瘤标志物。3.血清miR-182表达水平和胶质瘤患者预后显著相关,对患者预后评估有一定作用。意义本课题明确了胶质瘤患者血清miR-182表达水平与及其与病理分级的关系,并提示血清miR-182水平对胶质瘤早期诊断和预后分析有一定意义。第二部分microRNA-182对胶质瘤细胞增殖的影响及作用机制研究研究背景胶质瘤是最常见的神经系统原发性肿瘤之一,目前仍无有效的治愈手段。近年来虽多采用手术切除加辅助放化疗的综合治疗模式,但患者预后依然不佳,生存期一般约为14个月。导致胶质瘤预后不佳的根本原因在于它的一系列恶性生物学行为,包括肿瘤细胞的过度增殖、对周围脑组织的侵袭、化疗药物耐药等,尤其是肿瘤细胞的过度增殖,是导致术后快速复发的重要因素。如何有效抑制胶质瘤细胞的过度增殖,从而延长患者的生存期并改善其生存质量,是目前胶质瘤治疗领域的一大难题。对胶质瘤细胞过度增殖的分子作用机制进行研究,并针对其进行有效的干扰和抑制,以期能够寻找一种胶质瘤治疗的新靶点。近年来研究发现miRNAs可参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和凋亡的各个过程,通过结合目标mRNA的3’UTR区来调控目标基因的表达发挥作用。目前已经证实多种miRNAs与胶质瘤细胞的增殖、迁徙、凋亡和侵袭密切相关。如miR-663可以通过调节其目的靶基因TGF-β1来抑制胶质瘤细胞的增殖、迁徙和侵袭,miR-506的异常表达可调节其靶基因IGF2BP1来抑制胶质瘤细胞的增殖等等。miR-182是一种重要的miRNAs分子,在肿瘤细胞中过度表达,并促使细胞快速生长和增殖,这提示对miR-182的分子生物学作用机制进行研究可能有助于提高肿瘤的诊疗效果。研究表明卵巢癌时miR-182表达上调,调控其下游靶基因可促进肿瘤细胞的增殖。本课题第一部分研究已证实miR-182在胶质瘤患者血清中高表达,和患者的WHO病理分级等多种临床特征密切相关,然而miR-182在胶质瘤细胞中的表达情况及对增殖的影响及其作用机制尚不清楚。基于国内外研究进展和前期研究的结果,本课题组拟分析miR-182在胶质瘤细胞系中的表达情况及对细胞增殖作用的影响。寻找并验证miR-182下游靶基因,并分析它们在胶质瘤细胞增殖作用的分子生物学机制,以期为胶质瘤的治疗提供一种新的靶点。研究目的1.检测miR-182在U251、U118和LN319人胶质瘤细胞系和正常星形细胞中的表达情况。2.分别干扰和过表达miR-182,分析miR-182对增殖作用的影响。3.寻找并验证miR-182下游目标靶基因,研究抑制和过表达miR-182后对下游目标靶基因和蛋白表达水平的影响。4.分别干扰和过表达miR-182下游靶基因,研究其对人胶质瘤细胞系增殖作用的影响。5.分别干扰和过表达miR-182及下游靶基因,探讨miR-182-下游靶基因在胶质瘤细胞增殖中的作用机制。研究方法1. qRT-PCR检测miR-182在3种胶质瘤细胞系和正常星型细胞中的表达培养胶质瘤细胞系U251、U118、LN319和正常星型细胞,qRT-PCR方法检测miR-182在U251、U118、LN319胶质瘤细胞系和星型细胞中的表达情况。2.观察miR-182对胶质瘤细胞的增殖能力的影响采用脂质体Lipofectamine 2000瞬时转染方法按要求对U251胶质瘤细胞进行转染,分别干扰和过表达miR-182。 qRT-PCR方法检测转染效率。WST-1方法在第24小时、48小时、72小时和96小时对细胞的增殖能力进行检测。3.寻找并验证miR-182在胶质瘤细胞中的下游目标靶基因,研究干扰和过表达miR-182对靶基因转录水平及靶蛋白表达水平的影响运用microRNAs和miRBase等生物信息学数据库搜索miR-182的潜在目标靶基因,应用荧光素酶报告基因系统进行验证。运用qRT-PCR和Western blot方法分别检测miR-182对靶基因转录及蛋白表达水平的影响。4.分别干扰和过表达靶基因,研究其对人胶质瘤细胞增殖作用的影响分别干扰和过表达靶基因。运用qRT-PCR和Western blot验证干扰效率及过表达效率。WST-1方法对细胞进行增殖能力检测。5.探讨miR-182通过调控FOXO3在调节胶质瘤细胞增殖中的作用机制。分别干扰和过表达miR-182、干扰和过表达FOXO3,瞬时转染后48小时采用WST-1方法检测增殖能力,探讨miR-182及其下游靶基因FOXO3在胶质瘤细胞的增殖活动中的分子作用机制。研究结果1.miR-182在胶质瘤细胞系和正常星形细胞中的表达结果显示miR-182在胶质瘤细胞中的表达水平分别为LN319(0.1±0.05)、 U118(0.08±0.03)、U251 (0.24±0.05),明显高于正常星形细胞NHA(0.06±0.01)(均P<0.01)。三种细胞系的表达情况也有所差别,选择表达最高的U251细胞进行下一步实验。2.miR-182对胶质瘤细胞的增殖的影响分别将miR-182的mimics及inhibitor转染到胶质瘤细胞系U251中：与对照组比较,siRNA-miR-182表达明显下调(P=0.015),而miR-182 mimics表达明显上调(P<0.001)。培养48小时后,与空白对照组相比,miR-182 mimics组可明显促进胶质瘤细胞增殖(P<0.01),siRNA-miR-182组胶质瘤细胞增殖能力明显减缓(P<0.01)。选择细胞培养48小时时进行下一步实验。3.寻找并验证miR-182目标靶基因应用miRBase等数据库搜索到miR-182的潜在目标靶基因之一为FOXO3,且靶基因FOX03的3’-UTR区存在两个高度保守的碱基序列,能与miR-182特异性结合。利用荧光素酶分析实验对miR-182靶基因进行了鉴定,结果显miR-182mimics与WT FOXO33’-UTR共转染组的细胞荧光素酶活性明显低于其他转染组(P<0.01),提示FOXO3是其调控的重要下游靶基因之一。转染miR-182 mimics48h后,FOX03 mRNA(44.4%±6.96%,P=0.004)和蛋白(38.3%±.5.94%,P=0.006)水平下调。SiRNA-miR-182上调FOXO3 mRNA(2.08±0.41倍,P=0.002)和蛋白表达(2.09±0.38倍,P=0.004)。4. FOXO3对人胶质瘤细胞U251的增殖作用。qRT-PCR和Western blot验证FOXO3干扰效率及过表达效率满意。研究结果显示干扰FOXO3表达可上调胶质瘤细胞的增殖(1.40±0.04倍,P=0.006),而过表达FOXO3则可降低胶质瘤细胞的增殖(23.8%±2.44%,P=0.005)。5.miR-182通过调控靶基因FOXO3参与胶质瘤细胞的增殖作用调节分别干扰和过表达miR-182及其下游靶基因FOXO3,研究结果显示：过表达miR-182诱导的胶质瘤细胞增殖可被过表达FOXO3拮抗(P<0.001),而过表达miR-182与siRNA-FOXO3联合作用,则细胞增值上调作用更显著(P=0.018)。干扰miR-182后抑制胶质瘤细胞增殖作用可被siRNA-FOXO3拮抗(P=0.008),而干扰miR-182与过表达FOXO3联合作用对下调细胞增殖的作用更显著(P=0.006)。结论1.miR-182在人胶质瘤细胞系中高表达,可显著上调胶质瘤细胞的增殖。2. FOX03是miR-182的目标靶基因之一,参与调节胶质瘤细胞的增殖。3.miR-182通过调控FOX03来促进胶质瘤细胞的增殖。意义本课题明确了miR-182调控其下游目标靶基因FOXO3在胶质瘤细胞增殖过程中发挥作用的机制。而对miR-182进行干扰或过表达其靶基因FOXO3可能为胶质瘤提供新的治疗靶点。