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NADH氧化酶能以NADH为底物,在氧气存在的条件下生成NAD+。它可以与以NAD+为辅酶的氧化还原酶偶联,在催化氧化还原反应的同时生成NADH,从而使辅酶能够循环再生,提高催化反应的效率。虽然关于NADH氧化酶已有报道,但催化效率高且产物不含H2O2的较少。因此,制备高效NADH氧化酶具有现实意义。本课题从变异链球菌(Streptococcus mutans ATCC25175)中克隆到产水型NADH氧化酶,并对其进行了初步的生物信息学分析、表达以及酶学性质做了基本研究。首先,从Pubmed中搜索并确定1种含假定存在的NADH氧化酶的菌株(变异链球菌Streptococcus mutans ATCC25175),并得到NADH氧化酶的主要生物学信息:目的基因Sm NOX总长1374bp,共编码457个氨基酸,产物分子量为49.93k Da。把Sm NOX编码的NADH氧化酶序列与数据库中其他研究收录的酶进行比对,结果显示,NOX基因编码产物含1个半胱氨酸,为该酶的催化中心。肽链中含有两个FAD结合域(FAD-binding domain 1(GANHAGT),FAD-binding domain 2(TSIPDVYAIGDCA))和一个NADH结合域(NADHbinding domain(GAGYIGVELAE))。其次,对菌中的NOX基因进行了克隆表达。提取基因组后,根据DNA序列设计出两对引物,并进行PCR得到目的片段。扩增出的Sm NOX基因TA克隆于p GEM-T载体并转入大肠杆菌E.coli DH5α中。测序结果显示,Sm NOX基因序列中362位氨基酸发生了突变(F362L)。通过Bam HI和Xho I限制酶分别切割p GEM-T-Sm NOX与表达载体p ET-28a(+),将的基因与表达载体连接后转化进入宿主菌BL21(DE3)。随后诱导大肠杆菌表达,对表达产物以SDS-PAGE验证。然后,用Ni-NTA对Sm NOX进行了纯化,SDS-PAGE显示单一条带。随后对Sm NOX进行了酶学性质表征,结果表明:在FAD浓度为30μM、p H7.0、35o C条件下,NADH氧化酶达到最大比活力202.8U/mg,反应中无需加入金属离子,动力学常数Km、Vmax以及kcat/Km分别为247.9μM、281.7U/mg和2×106 s-1M-1,在室温下放置3 h后酶活力无明显变化。接着,筛选了一种来源于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 ATCC BAA-808)的短链脱氢酶Rs GDH(Gen Bank:HQ441199),该基因长780bp,编码259个氨基酸,蛋白分子量约为26.416k Da,经同源序列比对发现,该基因编码产物中含有一个NAD结合域(NAD-binding(TGGTQGAG)),用以结合辅酶NAD+,且与其他半乳糖醇脱氢酶有共同的残基Asn,Ser,Tyr,Lys,这些残基构成了该酶的催化活性位点,因此鉴定该酶为半乳糖醇脱氢酶(Rs GDH)。随后以同样的方式对Rs GDH基因进行克隆表达,克隆后大小与已知GDH序列相同,但308位碱基发生了突变(A308G)。用Eco RI和Hind III切割p GEM-T-Rs GDH与p ET-28a(+)后,将其转化至BL21(DE3)进行表达,Rs GDH基因产物以胞内可溶蛋白和包涵体两种形态存在。最后,对Rs GDH进行性质表征。结果表明:该半乳糖醇脱氢酶有广泛的底物特异性,其中以半乳糖醇为底物时有最大酶活力。与辅酶NADP+相比,Rs GDH具有更好的NAD+依赖性,且以金属Ca2+为辅因子。在NAD+浓度25m M、p H8.0、75oC条件下,Rs GDH有最大比活力5.8U/mg-protein,Km和Vmax值分别为30.7m M,23.5μmol/L/min。在65-75 o C条件下酶的热稳定性表明,Rs GDH是一种嗜热性的半乳糖醇脱氢酶,75 o C高温孵育1 h仍有60%以上酶活力,因此它在高温条件下的氧化还原反应中具有较好的应用。