近年来，人们对角膜缘干细胞的科学认识使得眼表疾病的治疗取得了突破性进展。除了常用的羊膜移植和角膜缘干细胞移植，生物组织工程学的发展提供了另外一种崭新的可供选择的治疗方式：培养的角膜缘干细胞移植。目前角膜缘干细胞组织工程的研究正在广泛开展，合理的体外培养体系是取得良好结果的最重要的前提。本研究旨在建立完善的人角膜缘干细胞组织工程复合体的体外培养体系，为进一步的临床应用作准备。为此我们首先采用兔对角膜缘干细胞的培养进行了初步摸索，之后建立了人角膜缘成纤维细胞滋养层的制备方法，最后建立了完整的以羊膜为载体的人角膜缘干细胞培养体系，并采用人角膜缘成纤维细胞作为滋养层，以进一步提高生物组织工程复合体在临床应用的安全性。天津医科大学博士研究生学位论文细胞悬液中间质细胞的含量;扫描电镜观察去除上皮的角膜缘基质表面，以确认能充分去除上皮细胞:采用细胞克隆形成试验检测细胞悬液形成克隆的能力。在进行两种方法的比较时，通过免疫组织化学技术观察两种方法培养的单层角膜缘上皮细胞△Np63的表达，采用流式细胞技术检测培养的细胞波形蛋白和角质蛋白的表达。对流式细胞结果，使用sPssll.0进行Mann一whitneyU检验。结果如下:1.使用Dispasell消化，能获得完整的角膜缘上皮。角膜缘上皮细胞悬液中间 质细胞的含量低于5%。2.角膜缘上皮细胞悬液细胞克隆形成率为34.7%。3.采用细胞悬液法培养，克隆融合后最终可分化成复层上皮细胞。组织块法培 养细胞难以分化成均匀一致的复层结构，且局部有成纤维细胞的污染。4.兔角膜缘上皮基底层细胞和靠近基底层的细胞，以及周边角膜上皮的基底层 细胞△Np63表达阳性。5.细胞悬液法培养的细胞中，△NP63阳性的细胞核较多。组织块法培养的细胞 △Np63阳性的细胞明显较少，且多分布在组织块周围。6.细胞悬液法波形蛋白和角质蛋白双阳性率要明显低于组织块法。 以上结果表明，由于分步消化能获得包括角膜缘上皮基底层细胞在内的纯的上皮细胞悬液，使用细胞悬液法培养能保证在培养体系中有一定的干细胞含量，最终可获得较好的培养结果。采用组织块法培养，干细胞并不能很好地从组织块上迁移出来，从组织块游出的细胞很可能大部份为短暂扩增细胞。第二部分人角膜缘成纤维细胞的培养以及丝裂霉素C对 它的生长抑制作用 在上皮细胞培养体系中作为滋养层的3T3成纤维细胞为鼠源性的永生细胞系，含有鼠源性异种基因和逆转录病毒基因，为临床应用带来了潜在威胁。我天津医科大学博士研究生学位论文们准备试用人角膜缘成纤维细胞替代3T3成纤维细胞，作为角膜缘干细胞体外培养的滋养层。为此我们对人角膜缘成纤维细胞进行了体外培养，并确定了丝裂霉素C(mitomycinC，MMC)对之发挥生长抑制作用的合适浓度，为下一步的应用做好准备。人角膜缘成纤维细胞可在体外扩增20代以上。4陀/m1的MMC能够有效抑制人角膜缘成纤维细胞的增殖。第三部分以羊膜为载体的人角膜缘干细胞的培养 对于严重的以角膜缘干细胞缺陷为特征的眼表疾病，传统的方法具有诸多局限性。随着生物组织工程学的发展，培养的以羊膜为载体的角膜缘干细胞移植己在临床应用中获得了初步成功。在本研究中，我们以去除上皮的羊膜作为细胞载体，采用细胞悬液法进行人角膜缘干细胞的培养，并尝试用人角膜缘成纤维细胞作滋养层，建立合理的人角膜缘干细胞生物组织复合体的体外培养体系，为临床应用做好准备。 试验分为两组，一组以3T3成纤维细胞作滋养层，另一组以人角膜缘成纤维细胞作滋养层。羊膜来自剖宫产的健康孕妇。消化分离获得人角膜缘上皮细胞悬液，接种于去除上皮的羊膜上，置于分别铺有两种滋养层细胞的培养板内培养。培养后期采用air-llfting技术促进细胞分化和细胞连接形成。细胞生长至单层和复层后，采用免疫组织化学技术和免疫荧光技术分别行细胞角质蛋白3(eytokeratin3，CK3)、△Np63和缝隙连接蛋白(connexin， ex43)的检测。复层细胞结构行透射电镜观察。去除上皮的羊膜表面行扫描电镜观察。结果采用sPsszl.o进行Man-n一WhitueyU检验。 结果如下:1.培养14天后，细胞铺满羊膜形成单层。28天后，上皮细胞分化为4一6层 细胞的复层结构，形态与正常角膜上皮相似。长成单层的角膜缘上皮细胞ANp63表达率较高，CK3和Cx43阳性率均较低。分化为复层以后，基底层细胞ANp63表达强阳性，不表达cK3和cx43，基天津医科大学博士研究生学位论文 底层以上细胞CK3阳性。与正常角膜缘上皮的表型一致。4.透射电镜显示复层上皮细胞之间有紧密连接和丰富的桥粒连接形成，上皮下 有新的基底膜物质形成，基底部细胞的胞浆有较多的乳头状突起伸入基底 膜。5.以上各点两组基本一致。 上述结果表明，我们以去除上皮的羊膜作为载体，采用细胞悬液法进行人角膜缘上皮细胞培养，角膜缘上皮细胞生长状态良好，能够分化成结构和表型与角膜缘上皮接近的复层上皮结构，上皮细胞和羊膜之间能够建立比较牢固的?