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植物在生长发育过程中,各器官通常需生长至特定大小以满足植物的生长需求。自然界中植物的花器官大小形状各异,尽管种间多样性非常高,但在恒定条件下生长的个体之间,特定物种的花瓣特征通常高度一致,这表明花器官大小受严格的遗传机制调控,同时受外部环境影响。本研究主要结合全基因组关联分析（genome-wide association analysis,GWAS）和转录组数据,挖掘调控甘蓝型油菜花瓣发育相关的关键候选基因。使用多位点混合线性模型对自然群体花瓣面积进行了GWAS分析,鉴定出与花瓣面积显著相关的17个单碱基多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）标记。自然群体中的一对极端差异材料花瓣表皮细胞学观察结果显示:花瓣面积的差异主要与细胞数目差异有关。极端差异材料的花瓣早期转录组差异表达基因GO富集分析发现,核酸合成代谢与细胞周期等相关基因显著上调。结合GWAS得到的候选基因、极端材料表皮细胞学观察和转录组分析结果,推测甘蓝型油菜中很可能存在的一种影响花瓣发育的途径:关键候选基因Bna.A05.RAP2.2a可能是通过抑制细胞周期来减少细胞分裂,从而使花瓣变小。1.花瓣面积的全基因组关联分析为了解析甘蓝型油菜花瓣面积大小的遗传群体结构,挖掘与花瓣大小密切相关的SNP位点和候选基因,我们选取了588份来自世界各地的具有广泛变异的甘蓝型油菜自交系进行了基因组重测序,并且考察了2016年至2018年所有株系的花瓣面积。为了全面且准确的检测与花瓣面积相关的SNP,我们采用了基于R语言的mr MLM软件包,将自然群体花瓣面积与过滤后的SNP数据进行GWAS分析。花瓣表型统计结果显示单个花瓣面积（SPA）大小变异广泛,在2016年、2017年和2018年分别为34.41-109.19、32-122和36-103 mm~2;平均值分别为69.73、72.23和65.96 mm~2;变异系数（CV）分别为20.06%、22.92%和20.08%。将2016-2018每一年的表型数据和3年的数据的BLUP结果均进行关联分析,最终一共鉴定出17个显著相关的SNP。这些SNP分布在A05、A07、A09、A10、C01、C06和C07染色体上,单个SNP对表型的贡献为1.59%-14.42%。为了验证SNP对花瓣大小的影响,将SNP最显著位点Bna-A05-p18392058对自然群体进行分类,发现在该SNP位点上基因型是G碱基的群体花瓣整体上比A碱基的群体花瓣大。2.植株表型考察与转录组分析为了解析甘蓝型油菜花瓣发育机制,我们选择了一对花瓣面积显著差异的自交系（Spe和Bpe）进行花瓣表型观察和转录组比较分析。花瓣表皮细胞的扫描电镜观察发现,每一个视野下,除花瓣基部外,大小花瓣间的细胞数目差异不显著。经过估算,单个大花瓣有350000到400000个表皮细胞,单个小花瓣则少于90000个表皮细胞。因此,花瓣面积差异主要是由细胞数目的巨大差异造成的。基于转录组的基因差异表达分析结果,共鉴定出20817个差异表达基因,其中上调表达8601个,下调表达12216个。差异表达基因的GO富集分析表明,上调表达基因显著富集于细胞生物合成过程、核酸代谢过程和细胞周期途径等生物学过程,而下调表达基因主要富集于细胞生长和调节细胞大小等生物学过程以及质膜、叶绿体类囊体膜和植物细胞壁等细胞成分。综合花瓣表皮细胞结构和转录组差异表达基因分析结果可以看出,大花瓣材料相比于小花瓣材料的细胞数目更多,在花瓣发育早期大花瓣材料的细胞增殖相关事件显著多于小花瓣材料。所以在这对自交系材料中主要是花瓣中细胞数目的极显著差异导致的花瓣面积之间的差异。3.候选基因筛选及其调控网络构建综合分析A05染色体贡献率最大的显著关联SNP位点Bna-A05-p18392058上下游500 kb区间内的基因和转录组结果中的差异表达基因,初步鉴定出关键候选基因Bna.A05.RAP2.2a。Bna.A05.RAP2.2a与显著关联SNP标记Bna-A05-p18392058相距304 kb。转录组数据分析结果显示,Bna.A05.RAP2.2a在小花瓣材料中显著上调表达,且在小花瓣中的表达量是大花瓣中表达量的10倍以上。Bna.A05.RAP2.2a含有AP2/ERF家族的AP2保守结构域,AP2/ERF基因家族中的许多基因都能够影响花器官中各个部位的生长发育,如At ANT、At AIL6、Os MFS1等。At RAP2.2、At RAP2.3和At RAP2.12在系统发育中属于同一分枝,At RAP2.3,At RAP2.12的拟南芥缺失突变体会形成更大的叶片。结合以上结果,我们推测Bna.A05.RAP2.2a可能是乙烯信号途径的响应因子,通过抑制细胞分裂来调控甘蓝型油菜花瓣大小。