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研究背景:现代医学证明,随着衰老,心血管疾病的发生率逐年上升。据美国心脏病协会(AHA)2015年数据统计显示,首发心血管事件平均发生率在80岁人群较40岁人群高约25倍,且在65岁以上人群中心脏病位列致死原因首位。临床和基础研究都证实,老年心肌对各种损伤(如缺血)的耐受能力显著减退且机制仍不明确。探索衰老心肌缺血易损的具体机制,提出针对性的老年心肌保护措施具有重要意义。心肌细胞作为终末细胞,细胞内异常事件的处理主要依靠细胞内自身途径。因此,蛋白质性能和细胞器质量的控制对于心肌意义重大。自噬在心肌细胞器转归(如受损的线粒体)和紊乱蛋白聚集物降解中发挥关键作用。老年个体心脏功能紊乱、抗损伤能力降低与衰老心肌自噬能力减退密切相关。与之对应,上调基础状态下心肌自噬水平有助于保护衰老心肌,对抗不可逆性损伤。细胞自噬能力受多种因素调控,最新发现的转录因子EB(TFEB)是介导自噬相关蛋白转录的重要调控分子。TFEB是MIT/TFE转录因子家族的成员之一,静息状态下,TFEB定位于细胞质中,当细胞遭受饥饿或应激后,TFEB转入细胞核发挥转录活性调控细胞自噬水平。TFEB对细胞自噬的诱导,融合,降解的全过程发挥转录调控作用。更为重要的,TFEB本身的转录活性受到翻译后修饰的调控。已有的体外实验证实,MAPK家族的ERK可对TFEB进行磷酸化修饰调节其核转位。但是,TFEB在细胞核内还会发生什么样的翻译后修饰?这种修饰对TFEB稳定性和转录活性有何影响?特别是,衰老心肌细胞核内TFEB的翻译后修饰仍属未知。针对心肌细胞核内TFEB翻译后修饰进行干预是衰老心肌自噬调控的新内容。SUMOylation(小泛素相关修饰物,Small Ubiquitin-like Modifier,SUMO)作为一种重要的翻译后修饰方式对蛋白质的功能有广泛的调节作用,主要包括调节蛋白质的细胞定位,蛋白质之间的相互作用以及蛋白质的活性等方面。现已发现,SUMO化修饰涉及多种生物学过程中的大量蛋白质,是心脏发育和功能完整的关键性调控事件。也有研究显示,SUMO化修饰异常与衰老心肌抗损伤能力减弱密切相关。SUMOylation的底物蛋白多位于细胞核内,且含有ψKXE模块序列(ψ:疏水氨基酸;K:赖氨酸,X:任意氨基酸)。我们采用SUMOplot分析程序发现TFEB在K348位点具有SUMOylation所必须的ψKXE模块序列(347VKQE350)。因此,本研究旨在探讨衰老心肌自噬功能障碍过程中SUMOylation发挥什么样的作用?SUMOylation是否与自噬调控的关键分子TFEB存在生物学联系?研究目的:1,明确心肌细胞核内SUMO化修饰对TFEB自噬调控的影响;2,证实TFEB-SUMO化修饰减退是否参与衰老心肌自噬功能障碍;3,明确干预TFEB-SUMO化修饰能否改善衰老心肌自噬功能发挥心肌保护作用。实验方法:本实验采用成年(4-6月龄)及老年(22-24月龄)雄性C57BL/6小鼠,提取组织蛋白,通过免疫共沉淀方法检测TFEB与SUMO1分子间作用,蛋白免疫印迹、实时定量PCR等方法检测TFEB,SUMO1,自噬相关蛋白LC3、Atg5、Beclin1及溶酶体相关蛋白LAMP1等分子的表达水平。采用小剂量雷帕霉素(0.25 mg/kg)处理成年及老年小鼠8周,检测上述分子变化。采用重组腺相关病毒9型(r AAV9)为载体在体抑制成年小鼠或过表达老年小鼠心肌SUMO1,腺病毒为载体抑制心肌TFEB,并构建心肌缺血/再灌注模型,提取组织蛋白,采用蛋白免疫印迹方法检测TFEB,SUMO1,自噬相关蛋白LC3、Atg5、Beclin1及溶酶体相关蛋白LAMP1等分子的表达水平,TUNEL染色、伊文氏蓝-TTC双染色检测心肌细胞凋亡及梗死面积。实验结果:1,采用免疫共沉淀实验发现,80k D的细胞核TFEB与SUMO1结合,发生了SUMOylation修饰;而68k D的胞浆TFEB并没有与SUMO1结合。结果证实:心肌TFEB可以被SUMO化修饰(SUMOylated TFEB),且主要发生在细胞核内。2,衰老心肌中TFEB水平较成年心肌显著降低。并且,对比成年心肌,衰老心2,衰老心肌中TFEB水平较成年心肌显著降低。并且,对比成年心肌,衰老心肌细胞核中SUMO化修饰的TFEB水平显著减退(P<0.05,n=5)。3,与成年心肌相比,衰老心肌自噬功能显著减退,表现为:自噬诱导因子LC3,beclin-1,Atg5表达减退;溶酶体蛋白LAMP2表达减退;自噬底物蛋白p62显著增加。4,在成年组,小剂量雷帕霉素处理可有效促进TFEB入核,提高核内TFEB水平并增强自噬。但是,对老年C57小鼠在体给予小剂量雷帕霉素处理,以成年C57小鼠为对照,我们发现,虽然雷帕霉素显著增加了成年心肌细胞核中TFEB水平,而老年小鼠心肌细胞核中TFEB水平并没有显著提高。为了明确TFEB的SUMOylation修饰和心肌自噬转录调控之间的联系,采用r AAV9为载体在体给予sh-SUMO1干预,利用r AAV9的亲心肌特性成功实现心肌SUMO1的敲低。重要的结果显示,随着SUMO1的敲低,心肌细胞核内TFEB水平随之减退(P<0.05,n=5)。并且,受TFEB调控的自噬相关蛋白LC3,LAMP2也被抑制。该结果提示,SUMO化修饰是心肌细胞核内TFEB保持蛋白稳定和转录活性的重要条件。5,反之,采用rAAV9为载体在体心肌过表达SUMO1水平,可显著改善衰老心肌细胞核内TFEB蛋白水平,并随之增强自噬相关蛋白的表达水平。6,采用sh RNA抑制TFEB表达后,SUMO1上调所引起的自噬增加效应随之消失,表现为LC3、LAMP1表达均明显下调。证实TFEB的SUMO修饰是衰老心肌自噬调控的关键环节。7,在上述基础上,通过调节TFEB的SUMO化修饰水平改善衰老心肌基础自噬水平可显著改善衰老心肌抗缺血损伤能力,减少心肌梗死面积和心肌细胞凋亡。实验结论:1,本研究证明了细胞核的SUMO化修饰TFEB调控心肌细胞自噬,并证明心肌细胞核内的TFEB-SUMO化修饰功能减退是衰老心肌基础自噬功能障碍的重要机制。因此改善TFEB的SUMO化水平是提高衰老心肌自噬能力的有效手段。2,通过调节TFEB-SUMO化修饰水平改善衰老心肌基础自噬最终可减轻衰老心肌缺血后损伤,实现心肌保护。