肺癌是目前世界上发生率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,并且呈明显上升趋势。最新的肿瘤流行病学调查显示,男性肺癌的发病率和死亡率居所有恶性肿瘤首位,女性肺癌死亡率也高居所有恶性肿瘤第二位。肺癌已经成为对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一。在本研究中,我们以肺癌为治疗目标,构建以IFN-y为目的基因的基因电路,以PEI-Fe3O4为基因载体,联合西妥昔单抗设计了靶向载基因磁性白蛋白纳米球,将分子靶向治疗、放疗和免疫基因治疗有效联合起来治疗肺癌。主要研究内容如下：第一章肿瘤治疗基因合成和表达研究：基于乏氧/辐射双调控基因电路技术的p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒的构建与鉴定及其在细胞内的诱导表达[目的]：构建pYr-ads-5HRE-cfosp-iNOS-IFNG(即p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG)真核表达质粒,并对其进行鉴定。评价其在GLC-82细胞中的诱导表达情况。[方法]：①以pUC57-Simple-cfosp为模板,将cfosp片段酶切下来连接至pYr-adshuttle-8载体得到pYr-ads-8-cfosp典核表达质粒。②以pDONR223-IFNG为模板,PCR扩增IFNG片段(IFNG即IFN-y的基因片段),然后将其亚克隆至pYr-adshuttle-8载体,构建pYr-ads-8-IFNG真核表达质粒。③将pUC57-SimpIe-cfosp及目的载体pYr-ads-8-IFNG双酶切,然后进行连接,构建pYr-ads-8-cfosp-IFNG真核表达质粒。④以pUC57-Simple-5HRE为模板,获得5HRE片段,并将其构建至pUC57-Simple-cfosp载体上,获得pUC57-Simple-5HRE-cfosp。再将其酶切,得到5HRE-cfosp片段,然后将其构建至pYr-adshuttle-8载体上,构建pYr-ads-8-5HRE-cfosp真核表达质粒。同时,将5HRE-cfosp片段,构建至pYr-ads-8-IFNG载体上,得到PYr-ads-8-5HRE-cfosp-IFNG真核表达质粒。⑤以pIRES2-ZsGreenl为模板,PCR扩增IRES片段,并将其构建至pYr-ads-1-iNOS载体上,构建pYr-ads-iNOS-TRESc再以pDONR223-IFNG为模板,PCR扩增IFNG基因片段,并将其构建至pYr-ads-iNOS-IRES载体上,得到pYr-ads-iNOS-IFNG。⑥ pUC57-Simple-cfosp为模板,PCR扩增cfosp片段,然后将其构建至pYr-ads-iNOS-IFNG载体上,得到pYr-ads-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒。⑦将5HRE-cfosp片段,构建至pYr-ads-iNOS-IFNG载体上,获得PYr-ads-5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒。⑧每个步骤后均需挑取阳性克隆,酶切测序鉴定后进行下一步构建,最后大量抽提质粒。⑨将pYr-ads-8-cfosp、pYr-ads-8-IFNG、pYr-ads-8-cfosp-IFNG、 pYr-ads-8-5HRE-cfosp-IFNG、pYr-ads-cfosp-iNOS-IFNG、pYr-ads-iNOS-IFNG、 pYr-ads-5HRE-cfosp-iNOS-IFNG分别转染GLC-82细胞,用2Gy X射线处理后,用QT-PCR分析IFN-y和iNOS(诱导型一氧化氮合酶)基因的表达量。评价基因电路的放大作用及乏氧序列的增强作用。⑩将P5HRE-cfosp-iNOS-IFNG质粒转染GLC-82细胞后,2Gy剂量的X射线照射后的6h、12h、24h、48h、72h收集细胞,分析IFN-y和iNOS基因的表达量。分别取转染后的细胞给予0、1、2、4、8Gy五种剂量进行X射射线照射后24h收集细胞,分析IFN-y和iNOS基因的表达量。[结果]：①酶切、测序鉴定结果表明每步均得到了目的质粒,测序发现插入片段序列无改变,并且开放读码框正确。②用QT-PCR检测IFN-y和iNOS基因的相对表达量,结果表明P5HRE-cfosp-iNOS-IFNG与其他质粒相比,表达量最高,与没有乏氧序列的组(⑥pYr-ads-cfosp-iNOS-IFNG)相比,IFN-y的表达量高了约1.46倍,iNOS的表达量高了2.11倍(p<0.05)。与没有基因电路的组(⑤Yr-ads-8-5HRE-cfosp-IFNG)相比,IFN-y的表达量高了约1.32倍(p<0.05)。③在处理后6h、12h、24h、48h、72h集细胞。用QT-PCR检测IFN-γ和iNOS基因的表达量发现,在诱导6h,IFN-γ和iNOS基因的表达量即开始升高,24h升到最高值。在24h之前,IFN-γ iNOS基因的表达量随时间的延长而增加,之后逐渐减低。④细胞给予0、1、2、4、8Gy五种剂量进行X射线照射后24h用QT-PCR检测IFN-y和iNOS基因的表达量发现,2Gy组的表达量最高,其IFN-y的表达量是1Gy组的4.37倍,4Gy组的1.52倍,8Gy组的2.05倍(p<0.05)。其iNOS的表达量是1Gy组的4.96倍,4Gy组的1.56倍,8Gy组的2.17倍(p<0.05)。[结论1：①成功构建了基于乏氧/辐射双调控基因电路技术的p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒及中间各用于比较的质粒。并且酶切鉴定、测序鉴定均证实构建成功。②用QT-PCR检测了C-fos启动子的时效性,C-fos启动子在2Gy的X射线诱导24小时后,靶基因的表达量最高。评价了p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG在肺癌细胞内的诱导表达,验证了HRE在缺氧环境中对辐射启动子的增强作用,和基因电路技术的有效性。第二章C225-Fe304/p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG(靶向载基因磁性白蛋白纳米球)的制备及靶向性研究[目的]：①制备表征Fe3O4磁性纳米粒,用PEI修饰Fe3O4磁性纳米粒并进行表征,研究PEI-Fe3O4复合物作为基因载体的可行性。②制备载基因磁性白蛋白纳米球及靶向载基因磁性白蛋白纳米球。③鉴定靶向载基因磁性白蛋白纳米球的免疫特性(即靶向性)并观察其转染效率。④从体内外水平,探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球对人肺癌细胞GLC-82细胞的靶向效应。[方法]：①采用化学共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒,聚乙烯亚胺(PEI)对其进行表面修饰。②采用透射电镜(transmission electron microscope, TEM), ZETA SIZER3000激光粒度分析仪,傅立叶红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)对修饰前后纳米粒进行表征。③琼脂糖凝胶电泳检测PEI-Fe3O4结合DNA的情况。利用pEGFP-Cl观察PEI-Fe3O4介导外源基因转染的效率。④采用去溶剂化-交联法制备载基因磁性白蛋白纳米球,用异型双功能交联剂SPDP耦连纳米球和西妥昔单抗(C225),制备成靶向载基因磁性白蛋白纳米球,运用TEM^ ZETA SIZER3000激光粒度分析仪对其表征,在不同时间点测其在PBS缓冲液和RPMI1640培养液中的粒径,评价其稳定性。动态测定其体外释放基因速率。用硫氰酸盐分光光度法测其含Fe量。⑤用靶向载基因磁性白蛋白纳米球转染GLC-82细胞,观察其转染效率。⑥运用玻片凝集实验、免疫荧光染色实验鉴定纳米球的免疫特性。⑦采用普鲁士蓝染色、细胞免疫荧光实验及细胞MRI实验观察靶向载基因磁性白蛋白纳米球与人肺癌细胞体外特异性结合的能力。⑧建立裸鼠肺癌移植瘤动物模型,待肿瘤直径达0.5cm左右用于实验,对裸鼠进行MRI。将裸鼠分成C225靶向组、非C225靶向组和C225抑制组。分别经尾静脉注射靶向载基因磁性白蛋白纳米球、非靶向载基因磁性白蛋白纳米球和靶向载基因磁性白蛋白纳米球+C225。在注射前及注射后2h、8h、24h、72h分别进行7.0 Tesla超高场强实验动物MRI系统成像,观察不同时间点肿瘤的信号变化,成像序列包括SE-TIWI、SE-T2WI、GRE-T2*WI。量化分析肿瘤组织信号改变的程度、范围、随时间的改变。测量感兴趣区(肿瘤、肌肉组织)T2WI及T2*WI信号强度,计算信号变化率。最后用SPSS 18.0统计软件进行统计、分析。病理组织学检查：包括常规HE染色、普鲁士蓝染色。[结果]：①制备的Fe3O4和PEI-Fe3O4磁性纳米粒表征：TEM检测显示磁性纳米粒电子密度高、大小较一致,并且修饰前后形态大小差别不大；FTIR结果显示了修饰后纳米粒的特征峰值,证明了PEI的成功吸附；激光粒度分析仪电位分析显示在pH为7的中性环境,Fe3O4纳米粒的zeta电位值为0±0.5mV,而PEI修饰后纳米粒子的电位值为36.3±0.6mV。②琼脂糖凝胶电泳检测到PEI-Fe3O4与DNA结合情况良好；PEI-Fe3O4可将外源基因转染至GLC-82细胞并高效表达。③自制的空载白蛋白纳米球及靶向载基因磁性白蛋白纳米球在TEM检测下为球形,大小均匀,并且在靶向载基因磁性白蛋白纳米球中明显地观察到在电子密度较低的白蛋白纳米球中包裹着电子密度较高的磁性纳米粒。ZETA SIZER3000激光粒度分析仪显示载基因磁性白蛋白纳米球的水合粒径为189.5±2.4nm；靶向载基因磁性纳米球的水和粒径约为211.9±3.1nm。在pH为7的中性环境中,载基因磁性白蛋白纳米球的zeta电位值是-37.9±0.4 mV,而耦联了C225的靶向载基因磁性白蛋白纳米球的电位值为-40.2±0.7 mV。在不同时间点测其在PBS缓冲液和RPMI1640培养液中的纳米球粒径差别不大,稳定性良好。④体外动态释放基因速率,计算其累积释放率显示,该材料15小时释放基因为96.45%,曲线平缓；硫氰酸盐分光光度法测含Fe量平均在2.2 mg/ml;转染实验结果显示靶向载基因磁性白蛋白纳米球能够有效转染GLC-82细胞,且转染效率高于非靶向载基因磁性白蛋白纳米球。⑤靶向载基因磁性白蛋白纳米球玻片凝集实验与对照组相比,靶向载基因磁性白蛋白纳米球组与抗血清孵育后观察到明显地凝集现象；免疫荧光染色显示靶向载基因磁性白蛋白纳米球表面发出明亮绿色荧光,而对照组未观察到荧光。⑥普鲁士蓝染色结果显示在靶向组与GLC-82细胞孵育后,细胞内有大量明显蓝染的铁颗粒存在,而非靶向组细胞内少见；细胞免疫荧光染色显示靶向组细胞的表面有绿色荧光,而非靶向组未观察到绿色荧光；细胞MRI实验结果显示靶向组与GLC-82细胞共孵育后在T2WI上信号强度不同程度的降低,而非靶向组与GLC-82细胞共孵育后在T2WI上信号强度无明显降低。⑦在体MRI成像结果显示,C225靶向组注射后肿瘤组织不同时间点的T2WI、 T2*WI强度及信号变化率均有明显下降,具有统计学差异(p<0.05)。而非C225靶向组和C225抑制组在注射后8h和24h两个时间点的信号亦有轻度下降,但下降幅度较C225靶向组小,且持续时间较靶向组短。不同时间点的T2弛豫时间,从24h时间点开始,C225靶向组与非靶向组和C225抑制组比较具有明显差异,结果有统计学意义(p<0.05)。⑧常规HE染色结果表明所建立的裸鼠荷肺癌皮下移植瘤动物模型符合小鼠肺癌的形态结构。普鲁士蓝染色结果显示：C225靶向组肿瘤组织内见较多的蓝染的颗粒,代表Fe颗粒多；而非C225靶向组和C225抑制组内少见蓝染的Fe颗粒存在。[结论]：①应用化学共沉淀法已成功制备了Fe304磁性纳米粒且PEI成功地修饰于Fe304磁性纳米粒。②修饰后的PEI-Fe3O4磁性纳米粒可以作为基因的载体。③成功制备了白蛋白纳米球、载基因磁性白蛋白纳米球,成功耦连了西妥昔单抗与载基因磁性白蛋白纳米球。④靶向载基因磁性白蛋白纳米球具有缓释作用,并且能高效转染人肺癌细胞GLC-82。⑤细胞实验和体内磁共振实验都说明靶向载基因磁性白蛋白纳米球对人肺癌细胞GLC-82具有良好的靶向效应。第三章基于基因和分子靶向治疗技术的靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的体内外实验研究[目的]：①体外水平探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗人肺癌的作用。②通过动物实验,从体内水平探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球对肺癌的治疗作用。[方法]：①体外采用CCK8及流式细胞技术测定靶向载基因磁性白蛋白纳米球体外治疗肺癌的效果。并用透射电镜观察细胞超微结构的变化。②建立裸鼠肺癌移植瘤模型,将靶向载基因磁性白蛋白纳米球经尾静脉注射入裸鼠,经辐射3次,6周后处死裸鼠。计算肿瘤体积抑制率和质量抑制率,制作肿瘤组织标本,进行常规病理学检查。③通过血清生化检查和血常规检测及各内脏器官组织病理学观察初步评价靶向辐射基因联合治疗的安全性。[结果]：①CCK8实验结果显示靶向载基因磁性白蛋白纳米球能明显抑制人肺癌细胞GLC-82的增殖,FCM检测显示其能诱导GLC-82细胞的凋亡,且其效果较其他组显著。透射电镜下可观察到各组细胞均有不同程度的凋亡,细胞内可见磁性材料沉积。②靶向辐射基因联合治疗组的肿瘤质量抑制率和肿瘤体积抑制率分别为82.54%和85.72%,明显高于单抗治疗组(36.51%、34.33%)、辐射放疗组(42.06%、40.89%)、辐射基因联合治疗组(64.29%、65.64%)和靶向辐射联合治疗组(70.63%、72.57%)(p<0.05)。③各治疗组肿瘤有不同程度坏死,部分坏死灶可见炎性细胞浸润。其中靶向辐射基因联合治疗组坏死程度最严重。可见大片坏死灶,坏死区域呈红染,肿瘤细胞崩解,胞核消失,部分细胞核固缩。其它治疗组也均有不同程度的坏死,程度较靶向辐射基因联合治疗组轻,但也可见肿瘤细胞的密度下降,细胞排列松散,胞浆呈红染。阴性对照组与各治疗组的心肝脾肺肾等内脏组织均没有发现明显的病理学变化。④建模前和治疗结束后各组裸鼠血细胞计数,各实验组与阴性对照组及建模前之间均无统计学差异(p>0.05)。提示建模和各治疗对骨髓造血系统无明显抑制作用。[结论]：①靶向辐射基因联合治疗能显著抑制培养人肺癌细胞GLC-82的增殖,诱导细胞凋亡。②分子靶向治疗、放疗和基因治疗三者联合治疗肺癌具有明显的协同作用,能有效抑制肺癌的生长,效果优于单一治疗也优于两两联合治疗。第四章靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的分子机制研究[目的]：从分子水平探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球介导的分子靶向联合基因治疗肺癌的机制。[方法]：①采用免疫组织化学方法检测治疗后各组肿瘤组织中Bcl-2、Bax、 survivin、VEGF、EGFR、PCNA、p53、Ki67蛋白的表达。②采用western blot检测各治疗组中Bcl-2、Ki67、survivin、caspase-3与caspase-8的表达量,使用Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析。从分子水平上探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球介导的分子靶向联合基因治疗肺癌的分子机制。[结果]：①单抗治疗组、辐射放疗组、辐射基因联合治疗组、靶向辐射联合治疗组、靶向辐射基因联合治疗组的Bax蛋白均有升高,但靶向辐射基因联合治疗组上升最明显。而单抗治疗组、辐射放疗组、辐射基因联合治疗组、靶向辐射联合治疗组、靶向辐射基因联合治疗组的Bcl-2、Ki67、p53、PCNA和survivin蛋白均有下降,其中靶向辐射基因联合治疗组下降得最明显。② Wesrern blot的结果显示,各治疗组与阴性对照组相比Bcl-2、Ki67、survivin均有下调,而caspase-3与caspase-8的表达上调。其中以靶向辐射基因联合治疗组最为显著。[结论]：靶向载基因磁性白蛋白纳米球介导的分子靶向联合基因治疗肺癌的机制可能与下调PCNA、Ki67蛋白表达而抑制肿瘤增殖；抑制Bcl-2、p53、survivin蛋白表达,上调Bax蛋白表达从而诱导肿瘤细胞凋亡；抑制肿瘤新生血管的形成,抑制EGFR表达有关。