PLOD2对胃癌细胞5-FU耐药的影响及其分子机制

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目的:胃癌(Gastric cancer,GC)是最常见的癌症之一,5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是治疗晚期GC的常用药物,5-FU常与其不同机制抗肿瘤药物联合应用增加治疗效果。然而,由于肿瘤细胞对化疗药物耐药从而使许多患者最终会治疗失败。目前越来越多的证据表明肿瘤的侵袭和转移不仅与肿瘤细胞的习性有关,更和肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)有着非常密切的关系,细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)是TME的重要构成部分,在肿瘤进展中起着重要作用。胶原蛋白是ECM的主要成分之一,其中ECM中最丰富的支架蛋白质就是胶原蛋白。赖氨酸羟基酶2(Procollagenlysine 2-xoglutarate 5-dioxygenase2,PLOD2)由PLOD2基因编码的蛋白,是介导稳定的胶原交联形成的关键酶,据报道PLOD2会增加几种GC细胞系的侵袭和迁移,但仍不清楚PLOD2在GC中耐药性的作用。本研究旨在确定PLOD2是否可以在GC中影响5-FU对GC的耐药性。方法:采用蛋白印迹(Western blot)检测PLOD2在MKN45、MKN28、MGC803、SGC7901、HGC27和BGC823和正常人胃粘膜细胞株GES-1中PLOD2的蛋白表达水平。构建PLOD2过表达质粒和PLOD2短发夹干扰RNA(sh RNA),应用慢病毒转染技术在PLOD2相对低表达的MGC803细胞和PLOD2相对高表达的BGC823细胞中构建稳转细胞株及对照组,命名为OE-PLOD2-MGC803、OE-Control-MGC803、sh PLOD2-BGC823、sh Control-BGC823。流式细胞术(FACS)检测稳转细胞的荧光效率,Western blot和实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测PLOD2在以上细胞中的蛋白表达水平和m RNA表达水平。CCK-8增殖试验检测5-FU对细胞增殖影响的变化;Transwell小室细胞实验验证5-FU对胃癌细胞迁移和侵袭能力的改变;流式细胞术检测5-FU导致的细胞凋亡影响的改变;建立异种移植瘤裸鼠模型,通过肿瘤生长曲线和组织学观察分析PLOD2表达下调后5-FU对肿瘤生长抑制作用的变化;免疫组化验证裸鼠体内肿瘤组织中PLOD2的表达情况。通过Western blot分析P-gp(MDR1)、MRP1、BCRP(ABCG2)、Bax和Bcl2的蛋白水平探究PLOD2影响5-FU对胃癌化疗耐药性的机制。结果:OE-PLOD2-MGC803细胞中PLOD2蛋白表达水平及m RNA水平较NC-MGC803和OE-Control-MGC803明显升高;sh PLOD2-BGC823细胞中PLOD2蛋白表达水平及m RNA水平较NC-BGC823和sh Control-BGC823明显降低(P<0.05)。5-FU对OE-PLOD2-MGC803细胞半数抑制浓度高于NC-MGC803和OE-Control-MGC803;5-FU对sh PLOD2-BGC823细胞半数抑制浓度低于NC-BGC823和sh Control-BGC823(P<0.05)。无论是否加入5-FU,OE-PLOD2-MGC803细胞迁移和侵袭能力高于NC-MGC803和OE-Control-MGC803;sh PLOD2-BGC823细胞迁移和侵袭能力低于NC-BGC823和sh Control-BGC823(P<0.05)。5-FU诱导的OE-PLOD2-MGC803细胞凋亡率显著低于NC-MGC803和OE-Control-MGC803;5-FU诱导的sh PLOD2-BGC823细胞凋亡率显著高于NC-BGC823和sh Control-BGC823(P<0.05)。体内实验,5-FU对sh PLOD2-BGC823组肿瘤生长的抑制效果更加显著。我们的机制研究表明,过表达PLOD2的细胞通过上调BCRP来抵抗GC细胞中5-FU的治疗效果,并且PLOD2通过影响Bax和Bcl2的蛋白表达来影响5-FU诱导的GC细胞凋亡。结论:PLOD2通过上调BCRP和抑制细胞凋亡增强GC细胞对5-FU的耐药性。
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