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大块骨缺损的修复及各种原因导致的骨折不愈合至今仍是骨外科领域尚待解决的重大课题，组织工程这门新兴学科的兴起使骨损伤的修复迈向了一个新的时代。组织工程中一个首要解决的关键问题是寻找满足要求和易于操作的种子细胞。目前已发现成人骨髓存在间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC），它们是一群具有多向分化潜能的均质性细胞，在特定的诱导条件下可分化为多种间充质组织细胞，如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、肝细胞和神经细胞等。在体外长期培养的过程中，MSC始终保持其多向分化潜能，且遗传背景相当稳定，体内植入反应较弱，是一种理想的组织工程种子细胞。然而，人体内骨髓中MSC的含量极其稀少，每1×105-1×106个单个核细胞中大约有1个MSC，组织工程中对种子细胞的数量要求巨大，如此微量的MSC难以满足组织工程的需要，因此体外纯化和扩增MSC就显得尤为重要。在本次实验对MSC的分离纯化方法是基于Friedenstein的经典方法进行的改进。具体的做法是从正常成人肋骨获得的骨髓细胞，用密度为1.073的Percoll分离后接种在含MSC专用培养基（Mesencult）的塑料培养瓶中，三天后用新鲜培养基对其进行全量换液，以后每周换液两次。待MSCs生长达80％融合状态时，用胰酶进行消化后按1：3的比列接种在三个塑料培养瓶中。在本次实验中成人间充质干细胞共扩增了15代，最后获得7.5×1012个MSC，扩增约1.36×107博士学位论文 中文摘要倍。 动物体内实验表明，用全骨髓移植到骨缺损处可观察到骨和软骨的形成，但这种转化具有随机性，且转化效率比较低，因此对其进行预分化处理就显得非常的重要。我们在进行定向诱导分化的同时比较了不同扩增代数的间充质干细胞向骨和软骨细胞转化的能力。具体的实验方法是在成骨诱导体系中，MSCS接种24 ，J’时后，加入诱导剂10－’mol＊地塞米松、10us／。16－甘油磷酸钠（p－GP）和 50 u g加l的抗坏血酸。在成软骨诱导培养体系中，间充质干细胞首先被低速离心成细胞微团，然后加入特定的诱导培养基和诱导剂10叼加ITGF十3。在诱导过程中动态观察细胞形态的改变和相应的生化和免疫学指标：I、11型胶原纤维，碱性磷酸酶、钙沉积和酸性蛋白聚糖。通过以上指标证实我们在体外己成功的诱导了MSCS分化为骨和软骨细胞，实验中发现不同扩增代数的MSC依然保持了向骨和软骨细胞分化的潜能。这一研究将为间充质干细胞的临床应用提供理论依据、技术方法和丰富的种子细胞。 体外扩增MSC的实验中，我们观察到成人和胎儿MSCS的增殖潜能具有明显的差异，另有文献报道胎儿MSC的分化潜能明显强于成人MSC，而胚胎期特异表达的基因可能在MSC的增殖分化过程中扮演重要的角色，对这些分子的发掘和研究将有助于提高我们对成人MSC增殖分化的调控，有助于发现与MSC定向分化相关的特异基因，而针对这些特异的基因进行调控将显著提高成人MSC定向分化的效率，因此，研究成人和胎儿间MSC基因表达的差异就显得极其的重要。基于上述理由，我们联合应用了抑制削减杂交和基因芯片技术筛选胎儿和成人MSC中差异表达的基因。 4博土学位论文 中文摘要 我们首先应用抑制消减杂交技术建立了胎儿MSC的CDNA消减文库。该方法通过将连有不同接头的两种待检样品CDNA分别与过量的对照样品CDNA进行杂交后，合并继续进行第H轮杂交，并且在杂交后利用对应于接头的特异性引物进行两轮抑制性PCR，扩增的产物通常便是同对照样品相比待检样品中差异（高）表达的基因。由于在杂交过程中引入过量的对照样品CDNA而使高、低丰度CDNA水平趋于一致，即均衡化＊ zation人 所以对于分离低丰度的差异表达基因十分有效。在我们建立的胎儿CDNA消减文库中包括了890个克隆，最后通过PCR检测获得了768个阳性克隆。通过SSH方法建立的消减CDNA文库可以同其它高通量筛选技术联合，对文库中的片段进行高效筛选。因此，我们采用了基因芯片技术对文库进行了高通量的筛选。本实验通过PCR方法对消减文库中的阳性克隆进行扩增，并利用芯片制备系统的机械手将扩增产物有序地点在处理过的载玻片上，制成基因芯片。将该芯片与不同荧光素标记的胎儿和正常成人MSC单链CDNA进行杂交，经不同严谨度洗片处理后，利用不同波长激光激发并读取各克隆散射的荧光信号，计算机定量分析信号强度，确定每个dNA克隆在两种组织中的相对表达水平，从而判断出在胎儿和正常成人MSC中差异表达的CDNA克隆。通过判定胎儿和成人MSC两者杂交信号比值小于0．3和大于3的为胎儿中差异表达的基因。在我们的结果分析中。胎儿MSC中高表达的克隆共有300个。从300个高表达的克隆中随机挑选了85个克隆进行序列分析，发现六个新基因片段，对其中克隆91号，尝试采用silico c1One方法进行全长的拼接，最后获得