棉花种子特异性动子的克隆、载体构建及△9Elo基因的转化研究

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:longyouxi
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我国是世界产棉大国,精炼棉籽油产量高(75~85万吨/年),在食用油和食品工业中应用广泛,而且棉籽油的亚油酸含量(49.5%~57.3%)明显高于其他油料作物,能为更高不饱和脂肪酸的合成提供充足底物。利用种子特异性启动子,可以使外源基因在种子中特异性表达,提高表达效果。  本研究克隆了两种棉花种子特异性启动子,分别构建了种子特异启动子驱动的△9脂肪酸延长酶基因(△9 fatty acid elongase gene,△9Elo)和GUS基因的植物表达载体,并对拟南芥和棉花进行了转化,获得转基因植株,检测到外源基因在拟南芥种子中特异性表达并且合成了目标产物。主要研究结果如下:  1.以海岛棉(Gossypium barbadense)新海40基因组总DNA为模板,通过touch downPCR技术,克隆了α球蛋白(α-globulin)基因启动子和胚胎发育后期丰富蛋白(Lateembryogenesis aboundant protein,LEA) D113基因启动子,分别命名为α和D,测序结果分析表明克隆片段长度分别为1104bp和1232bp,与已发表序列的相似性分别为98.92%和92.93%。除了含有TATA、CAAT等启动子的核心元件外,还含有B-Box、G-Box、AACA基序等一些种子特异性表达启动子的重要顺式元件和基序,并且呈多拷贝形式存在,具有较高的种子特异性。  2.对T1代的拟南芥进行GUS组织化学染色,结果显示,野生型的植株根、茎、叶、花和种子均未呈现蓝色,而转pBI121-α和pBI121-D的植株根、茎、叶、花都无蓝色出现,而种子均呈现蓝色,并且转pBI121-α的植株种子蓝色较深。表明α和D两种启动子均为种子特异性启动子,并且α启动子的启动活性略高于D启动子的活性。  3.对于转化pCamBAR-α-△9和pCamBAR-D-△9的拟南芥T2代的种子进行脂肪酸含量的分析,结果显示,在野生型的拟南芥种子中不含有EDA和ETrA,而在转基因的种子中都含有EDA(含量分别为7.3%和6.8%)和ETrA(含量分别为2.39%和2.34%),相应的LA和ALA的含量有所下降,LA的含量分别由38.13%降低到32.80%和31.78%,ALA的含量由29.31%降低到21.91%和23.45%。表明两种启动子都有效地启动了⊿9Elo基因在拟南芥种子中的表达。  4.以Sad1(硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶)为内参基因,利用实时荧光定量PCR,对获得的15株棉花阳性株进行外源基因△9Elo拷贝数的检测。用标准曲线估算外源基因相对于内参基因的拷贝数。结果表明,阳性植株中目的基因拷贝数为1~2个,其中单拷贝的有9株(60%),2个拷贝6株(40%),无假阳性植株。
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