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本文主要对具有纤溶活性的芽孢杆菌进行了研究,获得的菌株其代谢产物——纤溶酶具有溶解血栓的主要成分(纤维蛋白)的特性,该菌株是从传统的发酵豆制品中分离、筛选得到的,这为深入研究、开发传统发酵食品的功能性具有十分重要的意义。
本课题主要对以下几方面进行了研究:(1)传统发酵食品的功能性。传统发酵豆制品如豆豉、豆瓣酱、腐乳等通常作为食品被人们利用。本文以传统发酵豆制品豆豉、腐乳、豆瓣酱、纳豆等为菌源筛选材料得到产纤溶酶的菌株,确保了菌源的安全性,并且开拓了利用传统发酵食品的新途径——功能性食品。
(2)筛选方法的确定。本课题为了确定适合的筛选产纤溶酶能力高菌株的方法,对比了不同菌株在酪蛋白平板和血纤维蛋白平板上的溶解圈趋势,结果表明两种筛选方法具有正相关性。从而确定采用酪蛋白平板代替血纤维蛋白平板作为初筛方法,具有快速、简便、经济的特点。同时本试验也对传统的血纤维蛋白平板进行了改良,利用哺乳动物血液系统与人类血液系统具有相似性的原理采用无菌绵羊血制成模拟血栓来对菌株进行复筛,建立了准确的复筛方法。
(3)筛选产纤溶酶能力高的菌株。试验采用酪蛋白平板初筛与血纤维蛋白平板复筛相结合的方法,以国内外大豆发酵食品为菌源筛选材料,从中共分离出64株产纤溶酶的菌株,经过初筛得到8株产纤溶酶活力高的菌株,通过对初筛菌株的进一步复筛得到2株产纤溶酶活力最高的菌株YL-P2、YL-F2,酶活力分别达到了1122IU/mL和1137IU/mL。根据菌株的菌落形态、菌体形态、生理生化等特征确定YL-P2、YL-F2为枯草芽孢杆菌。
(4)对所筛选的菌株进行物理及化学诱变提高菌株产纤溶酶的能力。以枯草芽孢杆菌YL-P2、YL-F2作为出发菌株,分别采用紫外线(UV)诱变、硫酸二乙酯诱变、以及紫外线和硫酸二乙酯复合诱变,以酪蛋白平板法为初筛方法结合纤维蛋白平板复筛的方法选育纤溶酶活力高的菌株,获得了高产纤溶酶突变株UV-8。UV-8纤溶酶活力达到2314IU/mL,与出发菌株相比酶活力提高了2倍。经10次传代后菌株UV-8的纤溶酶酶活力达到稳定。
(5)对突变株发酵条件进行优化,产酶量达到最大。突变株UV-8在不同的发酵条件(温度、接种量、起始pH值、装液量)和发酵培养基的组成(碳源、氮源、金属离子、表面活性剂)等单因子试验基础上,结合正交实验得到该菌株的最适宜的液体发酵条件为:可溶性淀粉3%,酵母膏3%,吐温600.25%,复合金属离子0.2%,pH7.0,发酵温度35℃,装液量为50mL/250mL,4%接种量。
(6)对突变株UV-8代谢产物的活性进行了初步研究。通过测定含有不同成分的纤维蛋白平板确定纤溶酶的纤溶方式,测定发酵液和细胞提取液的纤溶酶活力判断菌株产纤溶酶为胞外酶还是胞内酶,通过加入不同饱和度的硫酸铵确定纯化纤溶酶的最适硫酸铵饱和度,同时测定了菌株代谢产物的体外溶栓性能、抑菌等特性。结果表明UV-8代谢产物只有直接溶解纤维蛋白的功能而不能激活纤溶酶原发挥间接溶解血栓的作用。确定纤溶酶的硫酸铵沉淀点应该选在50%。纤溶酶对血凝块的作用在12h和24h的溶解率分别为73.6%和98.6%,菌株代谢产物对常见的革兰氏阴性致病菌大肠杆菌和沙门氏菌有抑制作用。