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目的通过检测miR-410与VEGF在OS细胞系及OS组织中的表达水平,探索miR-410与VEGF是否存在相关性以及miR-410调控OS的分子机制。探讨miR-410在OS诊断和治疗中的重要性,并为开发基于miR-410的OS治疗策略提供理论依据。方法1.鉴定调节VEGF的潜在miRNA在OS中的表达。我们首先比较了五种OS细胞中的VEGF蛋白水平。Western blot结果显示,Saos-2和MG-63细胞中的VEGF水平高于其他OS细胞系。在线数据库（http://www.targetscan.org）用于预测调节VEGF表达的潜在miRNA。选择了四种miRNA,即miR-29a、miR-579、miR-410和miR-125a。为了确定这些miRNA中的所有或一些是否调节VEGF表达,我们构建了每个单独miRNA的特异性表达质粒,然后将它们单独转染到Saos-2和MG-63细胞中。Western blot检测各组VEGF水平。提取OS冰冻组织标本中总RNA,在RNA逆转录时应用miRNA-410特异性引物,检测miR-410表达,使2-△△Ct方法定量miR-410和VEGF的表达水平;Western Blot方法检测OS组织中VEGF的蛋白表达情况。为了进一步研究miR-410和VEGF之间的靶定关系,进行荧光素酶报告基因检测。2.外源miR-410能否抑制OS细胞增殖、侵袭,促进OS细胞凋亡?为了评估miR-410在VEGF阳性OS细胞中的功能,引入了miR-410前表达质粒。用对照质粒或miR410前体表达质粒转染MG-63和Saos-2细胞并在含有10%FBS的培养基中孵育。PCR检测miR-410水平。基于MT的细胞增殖测定miR-410是否抑制细胞生长。为了进一步验证miR-410对MG-63和Saos-2细胞的影响,通过流式细胞术和Transwell测定法分析细胞凋亡、迁移和侵袭能力。3.VEGF能否逆转miR-410对OS细胞的抑制作用?为了检测miR-410在OS细胞中的抑制作用是否由VEGF介导,使用不含3′-UTR的VEGF CDS表达质粒来抵抗miR-410在OS细胞中的负面影响。进行Western blot检测,与miR-410处理的OS细胞中的对照组相比,转染VEGF表达质粒是否改变了VEGF和p-AKT（ser473）的蛋白质水平。此外,Transwell和Cytometry分析,相比于对照组,VEGF是否可以逆转miR-410对OS细胞中细胞侵袭和凋亡的影响。4.MiR-410在体内能否抑制OS的肿瘤生长?为了确定miR-410在体内是否具有相似的功能,将稳定表达miR-410的MG-63和Saos-2细胞和对照组细胞分别接种到小鼠皮下。30天后,处死小鼠取出肿瘤并拍照。比较OS细胞组与对照组的肿瘤体积。选择每组六个肿瘤进行qRT-PCR和Western blot检测。结果1.MiR-410在OS中低表达,靶定VEGF,并与其表达呈负相关。Western blot结果显示,Saos-2和MG-63细胞中的VEGF水平高于其他OS细胞系。四种miRNA（即miR-29a、miR-579、miR-410和miR-125a）质粒分别单独转染到Saos-2和MG-63细胞中。转染miR-410后VEGF蛋白水平低于转染其它miRNA。OS样本检测结果显示miR-410与VEGF mRNA呈负相关（r=-0.7651）,miR-410与VEGF蛋白呈负相关（r=-0.8342）。双荧光素酶报告系统（Promega）测量萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性,结果表明miR-410直接与VEGF mRNA的3′-UTR结合。2.外源miR-410抑制OS细胞增殖、侵袭、迁移,促进OS细胞凋亡。用对照质粒或miR410前体质粒转染MG-63和Saos-2细胞,PCR结果表明miR-410水平在miR-410前体转染后增加,组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。基于MTS的细胞增殖测定显示,与转染对照质粒的细胞相比,miR-410强烈抑制细胞生长,组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。通过Transwell分析细胞侵袭能力,结果显示,miR-410过表达抑制OS细胞的侵袭,组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。通过Transwell测定法分析细胞迁移能力,结果显示,miR-410过表达抑制OS细胞的迁移,组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。通过Annexin V-PE/7-AAD双染法分析细胞凋亡,结果显示,转染miR-410组较对照组凋亡率显著增加,组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。3.VEGF逆转miR-410对OS细胞的抑制作用。使用不含3′-UTR的VEGF CDS表达质粒来抵抗miR-410在OS细胞中的负面影响并进行Western blot检测。Saos-2转染miR-410+VEGF组的VEGF及p-AKT（Ser473）的蛋白水平显著高于Saos-2转染miR-410组和Saos-2转染miR-410+pcDNA3.1组,差异有统计学意义（P<0.05）。MG-63转染miR-410+VEGF组的VEGF及p-AKT（ser473）的蛋白水平显著高于MG-63转染miR-410组和MG-63转染miR-410+pcDNA3.1组,差异有统计学意义（P<0.05）。为了验证VEGF逆转miR-410对OS细胞的抑制作用,通过Transwell测定法分析细胞侵袭能力。结果显示,Saos-2和MG-63转染miR-410+VEGF组侵袭能力明显高于转染miR-410组和转染miR-410+pcDNA3.1组,有统计学意义（P<0.05）。为了进一步验证VEGF逆转miR-410对OS细胞的抑制作用,通过Annexin V-PE/7-AAD双染法分析细胞凋亡。结果显示,Saos-2和MG-63转染miR-410+VEGF组凋亡率显著低于转染miR-410组和转染miR-410+pcDNA3.1组,有统计学意义（P<0.05）。4.MiR-410在体内抑制OS的肿瘤生长。Saos-2转染miR-410组肿瘤体积显著小于Saos-2转染pcDNA3.1组,有统计学意义（P<0.05）。MG-63转染miR-410组肿瘤体积显著小于MG-63转染pcDNA3.1组,有统计学意义（P<0.05）。选择每组六个肿瘤进行qRT-PCR,结果显示Saos-2转染miR-410组与MG-63转染miR-410组中miR-410表达显著上调,而VEGF表达在miR-410上调组中则明显下调,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。选择每组六个肿瘤进行Western Blot检测,结果显示Saos-2转染miR-410组与MG-63转染miR-410组中VEGF蛋白水平明显低于对照组。结论1.OS标本中miR-410低表达并与VEGF表达呈负相关,miR-410通过靶定VEGF调控OS细胞的生物学行为。2.MiR-410的上调抑制OS细胞增殖、侵袭、迁移,促进OS细胞凋亡。3.VEGF可以逆转miR-410对OS细胞的抑制作用。4.MiR-410在体内抑制OS的肿瘤生长。