广东地区犬瘟热病毒分子流行病学调查与病毒的分离鉴定及H抗原片段的原核表达

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从广东省多地采集患病犬的血液、体内组织样品,经过RT-PCR,扩增大小为481bp:经比对后鉴定,共检出90份阳性病料。  根据GenBank中已知的基因序列,通过软件比对,设计了一对扩增CDV H基因的全基因引物。提取经过鉴定为犬瘟热病料的病毒RNA,用RT-PCR扩增CDV H蛋白的全基因序列并连接到载体pMD18-T Simple上,转化感受态细胞,提取质粒,进行PCR鉴定及其序列测定。结果表明,成功扩增和克隆出该病毒H基因片段。随机选取10份病料的CDV H蛋白的基因序列,使用分析软件,对采集地区内毒株之间的H基因与参考毒株之间的H基因进行同源性比较分析。结果表明该病呈地区流行性,该地区内H基因的同源性为96.6%~99.8%:参考株的H基因与所采集的H基因同源性为89.9%~97.9%。使用软件预测H蛋白的糖基化位点数,发现野毒株的糖基化位点数为9个,而疫苗株的为4个或7个。  使用软件预测H蛋白的抗原性片段,设计一对扩增CDV H基因的抗原区域序列并引入相关的酶切位点,连接到pMD18-T Simple上,转化感受态细胞,提取质粒,进行PCR鉴定及其序列测定。结果表明扩增和克隆成功,得到pMD-CDV H抗原重组质粒,对pMD-CDV H和pET32a(+)进行双酶切,使用胶回收试剂盒回收目的片段,再使用T4DNA连接酶对其进行连接,转化感受态细胞,提取质粒,进行PCR鉴定、双酶切鉴定及其序列测定,结果表明成功构建pET-CDV H抗原重组质粒。将pET-CDVH重组质粒转化到表达菌,通过IPTG诱导,经过SDS-PAGE及Western-Blot鉴定,结果表明该抗原片段成功表达。
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