小麦多酚氧化酶分离纯化、酶学性质及抑制研究

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多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,PPO)是造成馒头、面条、饺子等中国传统面制品褐变的主要因素,PPO导致酶促褐变不仅降低了面制品的感官品质,而且破坏了其营养价值。目前国内对小麦PPO分离纯化、酶学性质及抑制的研究还比较少。本课题对扬麦158中的PPO进行分离纯化,分析了PPO的酶学性质以及抑制剂对PPO酶活的抑制作用,并探究了一些影响PPO酶活性的因素对小麦鲜面片色泽的影响。首先对从小麦麸皮中提取的PPO粗提物进行分离纯化。经硫酸铵沉淀、DEAE阴离子交换层析和Superdex200凝胶过滤层析,最终得到电泳纯的PPO。纯化后PPO总酶活回收率为7.03%,纯化倍数22.35,比酶活为373.44U/mg,电泳分析表明其分子量约为30kDa。其次对PPO的部分酶学性质进行了研究。测得其最适反应pH为6.5,最适反应温度为37℃;金属离子的研究表明,K+、Na+对其活性基本无影响,Ca2+、Mg2+、Mn2+略有激活作用,Zn2+、Cu2+激活作用较强;小麦PPO对邻苯二酚的Km值为6.90mmol/L,对焦性没食子酸(三酚类)、邻苯二酚(二酚类)底物亲和性较强,对单酚类(苯酚、愈创木酚)、二酚类(对苯二酚、间苯二酚)底物亲和性很低。然后研究了1mmol/L的VC、L-Cys、NaHSO3、曲酸、阿魏酸、4HR、甘氨酸二肽、肉桂酸、反式肉桂酸、草酸、柠檬酸对小麦PPO酶活性的影响,发现在1mmol/L浓度下VC、L-Cys、NaHSO3、4HR、阿魏酸、曲酸、甘氨酸二肽对PPO均有抑制作用,其中VC、L-Cys、NaHSO3抑制作用较强,可抑制约90%酶活;经动力学测定:VC、L-Cys、4HR、曲酸、甘氨酸二肽为竞争性可逆抑制剂,阿魏酸为反竞争性可逆抑制剂,NaHSO3为不可逆抑制剂。最后研究了影响PPO活性的因素(如抑制剂、温度、水分、酸碱度、气体环境等)对小麦鲜面片色泽的影响,结果表明抑制剂VC、L-Cys、NaHSO3、阿魏酸等的添加能够在一定程度上改善面片色泽;储藏温度降低、面片含水量减小以及面片偏酸性或偏碱性均有利于面片色泽的改善;真空包装或CO2气调包装也可以改善面片色泽。
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