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研究背景和目的 病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VMC)是病毒侵犯心脏引起的以心肌炎性病变为主的一种疾病。到目前为止，对其机制还有多处未搞清楚的地方，且缺乏值得信赖的治疗方法和药物，从中草药中寻找治疗该病的药物是一条新的治疗病毒性心肌炎途径。 研究证实，苦瓜(Momordica charantia L)具有抗病毒活性。苦瓜蛋白是我们从苦瓜果肉中分离出来的分子量为28kd的蛋白质(命名为Momordicin)，以前的研究显示其在体外有直接的抗病毒活性，并初步证实其对BALB／C小鼠CVB3心肌炎有治疗作用。 本项研究的目的：获得一种大规模制备苦瓜蛋白的方法，进一步深入研究其对BALB／C小鼠CVB3心肌炎的治疗作用，从NF-kB、炎性因子、凋亡三个方面入手，研究其治疗作用的机制。 方法 从苦瓜果肉中分离纯化苦瓜蛋白，高效液相色谱作质控。以CVB3感染培养大鼠心肌细胞，从心肌细胞搏动百分比(PBC)、细胞病变(CPE)、心肌酶谱、半感染致死量(TCID50)测定其对心肌细胞的保护作用。 动物实验分为预防和治疗作用两部分，治疗实验是在研究其剂量一效应关系的基础上，再研究其治疗作用的时效关系(注射病毒30分钟、4天后注射苦瓜蛋白治疗)。剂量一效应关系实验设6组：正常对照组(C)、病毒对照组(d)、药物对照组(Y)、高剂量治疗组(H，25mg／kg．d)、中剂量治疗组(M，8.3mg／kg．d)、低剂量治疗组(L，1.79mg／kg．d)。计算生存率，病理计分，TCID50、肌钙蛋白、CVB3 mRNA检测等。 博十学位论文 摘翌 凝胶滞留分析法检坝 NF－kB，从原位杂交、PCR和 western blot三个层次研究苦瓜蛋白对NF十B相关分子、TNF－Q、iNOS的影响。 用流式细胞术检测培养的凋亡心肌细胞，原位末端标记法对组织进行凋亡形态学分析，caspase3的活性用酶联免疫吸附法呸LISA）测定；分别从原位杂交、PCR和 western blot三个层次研究苦瓜蛋白对凋亡相关分于 b。X、bC12和 CSSp。Se3的影响。结果一 反相高效液相色谱和聚苯烯酚氨凝胶电泳鉴定证实所得苦瓜蛋白为较纯的分于量为28kd的目的物。苫瓜蛋白的对心肌细胞的半数抑制率为 7．86mg／ml，半数有效率为 0刀45mg／ml，苦瓜蛋白可显著提高心肌细胞PBC、降低病毒的复制，减少CPE，降低心肌酶。一 ①苦瓜蛋白对BALB／C小鼠CVB3心肌炎治疗作用有明显的剂量一效应关系k司．995人ED50－0．295mg／kg．d。高、中剂量的苦瓜蛋白可显著提高生存率，d组门6．7％人 H组u00％L M组00％人L组（7％人 三个剂量均可显著降低TCID50、炎性细胞浸润和心肌坏死。 ②苦瓜蛋白对BALB／C小鼠CVB3心肌炎没有顶防作m。其疗效与时间有关：病毒感染30分钟后治疗，生存率为100％门组为36．67％人差异显著，第 4大后治疗，生存率为 53．33％u组为 33．33％人 差异不显著。 ③三个剂量的苦瓜蛋白显著降低 血清 肌钙蛋白（TroPonin－cTn）水平和心肌组织CVB3滴度。一 正常对照组只有小量的 N卜kB活化，病毒对照组在 0、3、7、14、ZI天 NF十B的活化程度均明显高于正常对照组，苫瓜蛋白显著抑制NF十B k化，且呈明显的剂量一效应关系，其明显减少 IkB的降解， ．且巨 博十学仲论文 仰耍不能抑制 iNOS mKNA的产生，但可显著抑制 TNF－m mRNA的产生。 苦瓜蛋白可显著抑制感染CVB3的培养心肌细胞的凋亡（治疗组凋亡率为N ．27土7．05O，病毒对照组凋亡率为 35．41土2．88O入 动物水平的凋亡：病毒对照组第7天开始出现散在的凋亡细胞，第14天有较多的成团的凋亡细胞，且凋亡主要集中在病灶区域，病灶周围可见单个的凋亡的心肌细胞核；苦瓜蛋白可以明显抑制心肌细胞的凋亡：病毒对照组从第7大开始检测到caspase3活性，而在第7天后caspase3活性急居增加；苦瓜蛋白可以显著抑沾 caspase3、bax基因转录和蛋白表达，显著抑制b＊上的降解。结论1、建立了一种大规模制备苦瓜蛋白的方法，该蛋白对SD大鼠心肌细胞毒性较弱，且对其感染CVB3有较强的保护作用。2、苦瓜蛋白明显提高BALB儿小鼠CVB3心肌炎动物生存率，且有明显的剂量一效用关系；显著减少心肌病变的动物数量及炎性细胞浸润和心肌坏死，但没有预防效果；其疗效与治疗时间有明显的关系；显著降低肌钙蛋白 门roponin士Tn）产生及CVB3在心肌中的滴度。3、NFkB在BALBC小鼠CVB3心肌炎中持续活化，苦瓜蛋白有显著抑制其活化的作用，并明显抑制 IkB降解；不能抑制 iNOS mRNA的产生，明显抑制TNFa mRNA的产生。4、苦瓜蛋白显著抑制CVB3病毒对体外培养大鼠心肌细胞的致凋亡作用；在 BALB儿小鼠 CVB3心肌炎动物模型上有细胞凋亡发生，苫瓜蛋白可以明显抑制其细胞凋亡；其显著抑制caspase3，显著抑制hcf《基因和蛋白下调，显著抑制bax基因上调。