△S2 SF1a-PRLR对人乳腺癌细胞MCF-7增殖和microRNA表达的影响

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关于PRLR的众多研究表明,hPRLR基因的多态性及突变型在乳腺癌的形成与发展中发挥着重要作用,Delta S2 short form 1a PRLR(简称△S2 SF1a)为Tan等人于人类乳腺癌细胞及前列腺癌细胞中发现、克隆并首次报道的一类丢失了膜外区S2亚结构域的PRLR的变体,由PRLR基因转录后选择性剪接而来。我们推测,这一结构的缺失改变了PRLR的分子特性,可能引起下游细胞转导途径以及信号通路中的相关microRNA表达谱的改变,从而影响乳腺癌细胞的生物学特性。本文旨在研究△S2 SF1a-PRLR对人类乳腺癌细胞MCF-7增殖及microRNA表达的影响,并对差异microRNA进行分析,以探讨其在乳腺癌的发生发展中的潜在的作用及分子调控机制。本研究利用同源重组技术将SF1a-PRLR和△S2 SF1a-PRLR cDNA分别重组至慢病毒,再将携带不同基因的重组病毒即:空病毒、携带SF1a-PRLR cDNA的慢病毒、携带△S2 SF1a-PRLR cDNA的慢病毒分别转染至MCF-7细胞,经嘌呤霉素多次筛选得到其稳转细胞株MCF7-SF1a-PRLR(简称SF1a)、MCF7-△S2SF1a-PRLR(简称△S2 SF1a)、MCF7-Con(简称Con),将三组稳转细胞株培养后行细胞增殖测定(MTS方法)和提取总RNA行小RNA高通量测序,统计样品中人源的2588个microRNA的表达量(TPM值)比较三组稳转细胞microRNA表达差异。对差异表达的microRNA进行筛选,得到有意义的microRNA,并对差异microRNA进行GO和KEGG功能显著性富集分析。MTS结果显示:Con组、SF1a组、△S2 SF1a组细胞48小时OD均值为别为1.85±0.29、2.24±0.26、2.57±0.23,三组细胞OD值两两相比均具有差异性,且差异具有统计学意义(p<0.05)。测序统计分析结果显示在Con、SF1a、△S2 SF1a组分别获得16555647、14040683和13699542条序列,平均长度22 nt。Con组、SF1a组和△S2 SF1a组分别有992、895、828个microRNA的表达,且60%以上的microRNA表达量在1-1000之间。SF1a VS Con显著差异表达的microRNA共176个,其中32个表达上调,144个表达下调;△S2 SF1a VS Con显著差异表达的microRNA共206个,其中52个表达上调,154个表达下调;△S2 SF1a VS SF1a显著差异表达的microRNA共5个,其中4个表达上调,1个表达下调,它们分别是:miR-4454、miR-215-5p、miR-7977、miR-622、miR-210-5p(下调),其中miR-210-5p在三组样品中的表达两两相比均具有显著性差异。仅在△S2 SF1a组表达的microRNA有53个,仅在△S2 SF1a组不表达的microRNA有92个。其中miR-216b-5p、miR-767-5p、miR-522-3p、hsa-miR-3127-3p、hsa-miR-3197与Con组比较其差异具有统计学意义(p<0.05).Con组、SF1a组、△S2 SF1a组分别预测到618、595、580个新的microRNA。GO分析结果示:△S2 SF1a VS SF1a差异microRNA的靶基因示富集于上皮细胞增生、组蛋白H4乙酰化作用、投射神经元形态发生、神经发育、Wnt信号通路调节、表皮生长因子受体信号通路等生物过程以及钾离子通道激活、钾离子跨膜转运激活、SH3结构域结合等分子功能。KEGG通路富集分析示:△S2 SF1a VS SF1a差异microRNA的靶基因多集中于癌症相关通路包括Wnt、MAPK、AMPK、ERBB、TNF等信号通路。过表达的△S2 SF1a-PRLR、SF1a-PRLR均能促进MCF-7乳腺癌细胞的体外增殖,△S2 SF1a-PRLR比SF1a-PRLR的促进作用更明显。过表达△S2 SF1a-PRLR和SF1a-PRLR均可显著影响MCF-7乳腺癌细胞的microRNA的表达,但两者对大部分microRNA表达的影响相似。各组间差异表达的microRNA经过筛选得到的有意义的microRNA如miR-210-5p、miR-216b-5p、miR-767-5p、miR-522-3p、miR-3127-3p、miR-3197、miR-4454、miR-215-5p、miR-7977、miR-622等可能在促进乳腺癌细胞的形成和增殖中具有重要作用。
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