目的评价银杏酚酸(Ginkgolic acids, GAs)和银杏外种皮多糖(Ginkgo Biloba Exocarp Polysaccharide, GBEP)对小鼠免疫功能的影响。验证免疫毒性检测方法的敏感性,探索评价免疫毒性物质更全面、合理的试验方法,为建立我国免疫毒理学安全评价筛选体系提供参考。并研究银杏外种皮多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的调节作用,以期为银杏外种皮多糖作为功能食品原料的开发提供科学依据。方法1评价银杏酚酸对小鼠免疫功能的影响选用雌性BALB/c小鼠,试验分为5个免疫组,每个免疫组设6个试验组,即1个水对照组、1个油对照组、1个阳性对照组和3个银杏酚酸受试组。按体重将动物随机分组,每组15只动物。银杏酚酸高剂量为经口急性毒性LDso的25%,高、中、低剂量分别为350、117和39 mg/kg bw,其阴性对照组为油对照,阳性对照组每日经口给予60 mg/kg bw环磷酰胺(Cyclophosphamide, CTX)。试验周期为28天。试验结束后检测如下指标：免疫Ⅰ组：对绵阳红细胞(Sheep Red Blood Cell, SRBC)初级免疫应答反应、血清半数溶血值的测定；免疫Ⅱ组：NK细胞(Natural Killer cell)活性测定、对有丝分裂原脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)的反应和对有丝分裂原刀豆蛋白A(Concanavalin A, ConA)的反应、细胞毒性T细胞(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL)的活性检测；免疫Ⅲ组：血液学、血生化、血浆免疫球蛋白、组织病理学的测定、外周血淋巴细胞表型分析、体重和主要免疫器官及其它脏器的重量及脏体比；免疫ⅣV组：小鼠碳粒廓清能力的检测。免疫V组：迟发型变态反应(Delayed-Type Hypersensitivity, DTH)。2评价银杏多糖对小鼠免疫功能的影响2.1评价银杏多糖对正常小鼠免疫功能的影响选择雌性BALB/c小鼠,试验分为5个免疫组,每个免疫组分别设立4个试验组,即1个阴性对照组和3个银杏多糖剂量受试组。按体重将动物随机分组,每组10只动物。依据银杏多糖的“动物最大给药量”设定GBEP高剂量为10.00g/kg bw,并依次设GBEP中、低剂量分别为3.33g/kg bw和1.11g/kg bw,其阴性对照组为水对照组,阴性对照组每日给予蒸馏水。给药方法为灌胃法,连续给药28d。之后检测如下指标,免疫Ⅰ组：对SRBC初级免疫应答试验、血清半数溶血值的测定；免疫Ⅱ组：NK细胞活性测定、对有丝分裂原LPS的反应、对有丝分裂ConA的反应、细胞毒性T细胞的活性检测；免疫Ⅲ组：血液学、血生化、血浆免疫球蛋白、组织病理学的测定、外周血淋巴细胞表型分析、体重和主要免疫器官及其它脏器的重量及脏体比；免疫ⅣV组：小鼠碳粒廓清能力的检测。免疫V组：迟发型变态反应。2.2评价银杏多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的调节作用选择雌性Balb/C小鼠,试验分为5个免疫组,每个免疫组分别设立6个试验组,即1个阴性对照组、1个阳性对照组和4个银杏多糖剂量组,按体重将动物随机分组,每组10只动物。依据银杏多糖的“动物最大给药量”设定GBEP高剂量为10.00g/kg bw,并依次设立GBEP中、低剂量为3.33g/kg bw和1.11g/kg bw,参照关于GBEP的其它研究,设立GBEP极低剂量为0.10g/kg bw。5个免疫组给药方法如下：阴性对照组给予蒸馏水；阳性对照组给予60mg/kg bw环磷酰胺；A组给予60mg/kg bw环磷酰胺及10.00g/kg bw GBEP; B组给予60mg/kg bw环磷酰胺及3.33g/kg bw GBEP; C组给予60mg/kg bw环磷酰胺及1.11g/kg bw GBEP; D组给予60mg/kg bw环磷酰胺及0.10g/kg bw GBEP。给药方法为灌胃法,连续给药28d。试验结束后检测如下指标：免疫Ⅰ组：对SRBC初级免疫应答试验、血清半数溶血值的测定；免疫Ⅱ组：NK细胞活性测定、对有丝分裂原LPS的反应、对有丝分裂原ConA的反应、脾细胞培养上清中细胞因子的测定；免疫Ⅲ组：血浆免疫球蛋白、外周血淋巴细胞表型分析、体重和主要免疫器官的重量及脏体比；免疫Ⅳ组：小鼠单核巨噬细胞的功能。免疫Ⅴ组：迟发型变态反应。结果1银杏酚酸对小鼠免疫功能的影响1.1用环磷酰胺建立免疫毒性评价程序和方法本研究中采用环磷酰胺作为阳性对照物,由常规标准毒性试验结果可知,阳性对照组小鼠体重、胸腺绝对和相对重量、肝脏和肾脏绝对重量均较水对照组显著性降低。组织病理学检测结果显示阳性对照组小鼠脾小结明显萎缩、纤维化(发生率为60%)、纤维组织增生(发生率为10%),伴红髓窦扩张；淋巴结正常结构消失,淋巴滤泡萎缩消失,纤维化,髓窦扩张。肝脏出现小叶周边或弥漫性肝细胞胞浆呈现小或细小空泡形。血液学结果显示阳性对照组白细胞(White Blood Corpuscle, WBC)、淋巴细胞百分比(lymphocyte, LYM)较水对照组显著降低,中性粒细胞(Neutrophilic Leukocyte, NEUT)、嗜酸性粒细胞(Eosinophils, EOS)较水对照组显著升高。血生化结果显示阳性对照组白蛋白(Albumin, ALB)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)水平下降,血尿素氮(Blood Urea Nitrogen, BUN)水平升高。阳性对照组血浆IgA和IgG水平较水对照显著降低。外周血淋巴细胞表型分析结果显示阳性对照组T淋巴细胞和B淋巴细胞百分比、辅助性T淋巴细胞(helper T lymphocyte, Th)和抑制性T淋巴细胞(suppressor T lymphocyte, Ts)百分比以及CD4+/CD8+比值均较水对照组显著降低。对SRBC初级免疫应答反应和血清半数溶血值试验显示阳性对照组小鼠溶血空斑数和血清半数溶血值较水对照组均显著降低。阳性对照组T淋巴细胞和B淋巴细胞分别对有丝分裂原ConA和LPS的增殖反应、CTL细胞活性、NK细胞活性和迟发型变态反应均较对照组显著降低。1.2银杏酚酸对小鼠免疫功能的影响本研究中,水对照组与油对照组比较各项指标无显著差异。银杏酚酸的常规标准毒性试验结果表明,银杏酚酸高剂量组小鼠体重和脾脏绝对重量较油对照组显著降低,银杏酚酸三个剂量组小鼠肝脏绝对重量和高剂量组肾脏绝对重量均较油对照组显著降低。组织病理学结果显示脾小结增生发生率为：银杏酚酸低剂量组(60%),中剂量组(60%),高剂量组(20%),且检出数量高于对照组(10%)。血生化结果显示银杏酚酸低、中、高剂量组小鼠BUN水平升高。附加免疫功能试验中外周血淋巴细胞表型分析结果显示,银杏酚酸低剂量组小鼠T淋巴细胞和Th淋巴细胞百分比均较油对照组显著升高,B淋巴细胞百分比较油对照组显著降低；银杏酚酸中剂量小鼠T淋巴细胞百分比均较油对照组显著升高；银杏酚酸高剂量组小鼠T淋巴细胞百分比较油对照组显著升高,B淋巴细胞百分比较油对照组降低。银杏酚酸中剂量组和高剂量组小鼠溶血空斑数显著减少且高剂量组小鼠血清半数溶血值也显著降低。银杏酚酸各剂量组小鼠对有丝分裂原LPS和ConA反应无显著变化。银杏酚酸各剂量组小鼠CTL细胞活性显著降低。非特异性免疫试验结果显示,银杏酚酸三个剂量组小鼠NK细胞活性均显著降低。2银杏外种皮多糖对小鼠免疫功能的影响2.1银杏外种皮多糖对正常小鼠免疫功能的影响试验结果表明银杏外种皮多糖高剂量组淋巴结绝对和相对重量较阴性对照组显降低,GBEP低、中剂量组淋巴结绝对重量较对照组显著降低。GBEP低、中、高剂量组动物肝脏绝对重量较阴性对照组显著降低,GBEP高剂量组肾脏绝对重量较阴性对照组显著降低。组织病理学检测结果显示银杏外种皮多糖低、中剂量组脾脏、淋巴结偶见个别动物纤维组织增生和纤维化改变,高剂量组未见脾脏和淋巴结出现类似改变,其它脏器组织学病检未见异常。血液学检测结果显示GBEP各剂量组平均血小板体积(Mean Platelet Volume, MPV)较阴性对照组显著降低,其它血液学指标与阴性对照组无显著差异。GBEP各剂量组动物血生化检测结果与对照组比较未见显著差异。免疫球蛋白检测结果显示GBEP中剂量组血浆IgA和IgG水平较阴性对照显著升高,GBEP高剂量组血浆IgA水平较阴性对照组显著增高,而血生化检测中GBEP组小鼠总蛋白和白／球蛋白比值与对照组无显著差异。附加免疫功能试验结果表明,GBEP各剂量组T淋巴细胞百分比、Th细胞百分比和Th/Ts(CD4+/CD8+)比值较对照组显著升高。GBEP各剂量组小鼠溶血空斑数和血清HC50较阴性对照组无显著差异。GBEP各剂量组小鼠的淋巴细胞对ConA和LPS的增值能力较对照组无显著差异；CTL细胞活性较对照组有升高趋势,亦无统计学差异；GBEP各剂量小鼠迟发型变态反应、NK细胞活性和小鼠碳粒廓清能力较对照组无统计学差异。2.2银杏外种皮多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的调节作用与阴性对照组相比,阳性对照组组小鼠体重、脾脏重量和胸腺重量明显降低。阳性对照组组小鼠CD3-CD19+ B细胞百分比、CD3+CD19- T细胞百分比、CD3+CD4+CD8-T细胞百分比和CD3+CD4-CD8+ T细胞百分比明显降低。体液免疫功能试验结果显示,阳性对照组组小鼠PFC值明显降低,阳性对照组组小鼠HCso值明显降低,阳性对照组组小鼠血清IgG和IgM浓度显著降低。细胞免疫功能结果显示,阳性对照组组小鼠ConA和LPS诱导的淋巴细胞增殖能力显著降低。阳性对照组组小鼠TNF、IL-5、IL-4和IL-2浓度显著降低,阳性对照组组小鼠DTH反应较阴性对照组无显著差异。阳性对照组组小鼠NK细胞活性显著降低,单核巨噬细胞吞噬率和吞噬指数显著降低。与阳性对照组组比较,CTX+GBEP低剂量组小鼠脾脏绝对及相对重量显著增加。与阳性对照组组比较,CTX+GBEP中、低和极低剂量组胸腺绝对及相对重量显著增加。CTX+GBEP高剂量组小鼠CD3-CD19+ B细胞百分比显著增加；CTX+GBEP中剂量组小鼠CD3-CD19+ B细胞百分比和CD3+CD4-CD8+ T细胞百分比显著增加,但CD4+/CD8+比值降低；GBEP低和中剂量组CD3-CD19+ B细胞百分比、CD3+CD19- T细胞百分比CD3+CD4+CD8- T细胞百分比和CD3+CD4-CD8+ T细胞百分比显著增加。体液免疫功能结果显示,CTX+GBEP各剂量组小鼠血清HC50值明显升高；CTX+GBEP各剂量组小鼠PFC值明显升高；CTX+GBEP高剂量组小鼠血清IgM浓度显著增加；CTX+GBEP中剂量组小鼠血清IgG、IgA和IgM浓度显著增加；CTX+GBEP低和极低剂量组小鼠血清IgG和IgA浓度显著增加。细胞免疫功能结果表明：CTX+GBEP各剂量组小鼠ConA诱导的淋巴细胞增殖能力及中、低、极低剂量三组小鼠LPS诱导的淋巴细胞增殖能力显著升高。CTX+GBEP高剂量组小鼠TNF、IFN-γ、IL-5、IL-4和IL-2浓度显著升高,CTX+GBEP中剂量组小鼠TNF和IFN-γ浓度显著升高；CTX+GBEP低剂量组小鼠TNF浓度显著升高；CTX+GBEP极低剂量组小鼠TNF、IFN-γ和IL-2浓度显著升高；CTX+GBEP各剂量组小鼠足趾显著增厚。非特异性免疫功能结果表明：CTX+GBEP低、极低剂量组小鼠NK细胞活性显著增高。CTX+GBEP各组小鼠单核巨噬细胞吞噬率显著升高,CTX+GBEP高、中、极低剂量组小鼠单核巨噬细胞吞噬指数显著升高。结论1用环磷酰胺建立了免疫毒性模型。所用实验方法包括常规标准毒性试验和附加免疫功能试验。常规标准毒性试验方法涉及血液学、免疫器官重量和组织病理学、血浆免疫球蛋白；附加免疫功能试验方法包括对SRBC初级免疫应答反应、血清半数溶血值的测定、外周血淋巴细胞表型分析、对有丝分裂原的反应、细胞毒性T细胞的活性检测、迟发型变态反应、巨噬细胞功能和NK细胞功能。2在本研究剂量下,银杏酚酸对小鼠的某些脏器有免疫病理性损害,对小鼠的体液免疫功能、细胞免疫功能和非特异性免疫功能有抑制作用,可判定银杏酚酸对小鼠的免疫功能有免疫抑制作用。3 GBEP对正常小鼠的免疫功能基本无毒副作用。4本研究表明在3.33g/kg, 1.11g/kg和0.10g/kg剂量,GBEP对于CTX免疫抑制小鼠的免疫功能具有显著的调节作用。在高剂量10.00g/kg bw时,GEBP的免疫调节功能不明显。