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目的: 选择证实与血栓形成有关的突变位点,即T1565C(Leu33→Pro),构建稳定表达野生型和突变型GPIIb/IIIa的CHO细胞系,进而证明载体T1565C突变能增强GPIIb/IIIa的表达,引起血小板功能的改变。
方法: 选择人红白血病(human erythroleukemia,HEL)细胞提取人基因总RNA,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),利用定点诱变技术设计合成引物,采用聚合酶链反应定点诱变技术,通过三轮聚合酶链式反应将GPIIIa第2外显子进行扩增。将第2外显子1565位基因由T置换为C,把最终产物与质粒pcDNA3.1(+)经双酶切(Hind III和Nhe I),连接,转化,最终构建质粒pcDNA3.1(+)IIIa。结合同时构建的野生型pcDNA3.1(+)IIb和pcDNA3.1(+)IIIa,采用阳离子脂质体法进行分别和共转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中进行表达,经G418筛选出稳定表达的GPIIb/IIIa突变体的CHO细胞系。通过流式细胞仪(FCM)和血小板聚集仪检测、鉴定野生型和突变型pcDNA3.1(+)IIb/IIIa在CHO细胞的表达以及血小板聚集功能(PAgT)情况。
结果: 成功获得人血小板GPIIIa突变体及其表达载体pcDNA3.1(+)IIIa,经酶切、PCR和测序分析,除引入突变位点产生预期T1565C突变外,其余碱基序列无改变。野生型和突变型pcDNA.3.1(+)IIb/IIIa重组质粒转染的CHO细胞经FCM均有GPIIIa表达,空载体pcDNA3.1(+)CHO细胞表面无GPIIIa表达。野生型和突变型pcDNA3.1(+)IIb/IIIa均有血小板聚集功能。
结论: (1)成功构建人血小板GPIIIa突变体及其表达载体pcDNA3.1(+)IIIa。(2)成功地得到稳定表达野生型和突变型GPIIb/IIIa的CHO细胞系。