绒山羊绒毛是由次级毛囊产生的,具有“软黄金”的美誉,是高档纺织材料,并且次级毛囊是研究毛发再生循环机制的模型。本文拟通过研究陕北白绒山羊次级毛囊发育循环周期的分子机理,进而为提高绒山羊绒毛质量、增加绒毛产量提供理论基础,同时也为毛发再生的研究提供参考。本研究旨在精确定位次级毛囊周期循环的时间节点,筛选调控毛囊周期循环的关键基因,揭示非编码基因在毛囊周期循环调控中的作用。主要研究内容包括以下几个方面:1)通过显微测量对陕北白绒山羊全年不同月份次级毛囊长度及其毛球部宽度进行量化,揭示次级毛囊周期循环的时间节点规律;2)通过联合分析绒山羊次级毛囊发育三个典型阶段(生长期、退行期和休止期)的mi RNA和m RNA数据,筛选出调控毛囊周期循环关键的mi RNAs和m RNA,并构建了mi RNA-m RNA调控关系网络;3)通过“全转录组学”测序技术深入分析次级毛囊从“生长期”向“退行期”转变的分子调控机制;4)利用双荧光素酶检测系统验证了mi R-144-3p与LHX2的靶向调控关系,并通过mi R-144腺病毒感染毛乳头细胞及构建LHX2-/-毛乳头细胞株进行其基因功能研究。本研究取得主要研究结果如下:1、通过对陕北白绒山羊全年皮肤样品中次级毛囊的形态显微测量,发现长度变化为1070.16μm至2267.61μm,次级毛囊毛球部宽度变化为44.05μm至108.61μm;根据次级毛囊在皮肤中的长度和毛球部宽度的变化规律,得出陕北白绒山羊次级毛囊发育周期规律为:5月份到10月份为次级毛囊生长期(9~10月份,旺盛期),11月份到次年2月份为次级毛囊退行期,次年3月份到次年4月份为次级毛囊休止期。2、通过对陕北白绒山羊生长期、退行期和休止期皮肤样品中mi RNAs和m RNAs表达变化联合分析,发现“生长期与退行期”比较有104个差异的mi RNAs和683个差异m RNAs参与mi RNA-m RNA网络调控构建,共构建5694条靶向网络调控关系;“生长期与退行期”比较有92个差异的mi RNAs和583差异m RNAs参与mi RNA-m RNA网络调控构建,共构建4185条靶向网络调控关系;“退行期与休止期”比较有57个差异的mi RNAs和125差异m RNAs参与mi RNA-m RNA网络调控构建,共构建574条靶向网络调控关系;对mi RNA靶基因进行GO功能富集,发现有48个显著富集的类别,且富集的功能类别符合生长期、退行期和休止期次级毛囊在皮肤中的生长发育特点;KEGG显著富集的通路有Focal adhesion、Protein digestion and absorption、ECM-receptor interaction、Cardiomyopathy related pathway、Regulation of actin cytoskeleton和PPAR signaling pathway等,发现皮肤下脂肪细胞亦可能是潜在调控次级毛囊周期循的关键因素;在“生长期/退行期”比较中,通过对mi RNA表达量倍数限定(1.5倍)和本底表达量限定(>50),筛选出5个候选mi RNAs,分别为mi R-1、mi R-125b、mi R-144、mi R-145和mi R-206。3、通过对陕北白绒山羊生长期和退行期的皮肤总RNA进行全转录组测序分析,发现403个新的lnc RNA转录本和307个新的mi RNA,同时鉴定出3500个差异可编码m RNA的转录本(共3357个基因)、172个差异的lnc RNA转录本和72个差异表达mi RNAs;对lnc RNA和mi RNA共有靶基因进行通路分析,发现许多疾病相关的通路(如pathways in cancer、systemic lupus erythematosus和Transcriptional misregulation in cancer),除此之外,还发现脂肪沉积相关的代谢通路(如PPAR signaling pathway)、环境信息处理相关的通路(如ECM-receptor interaction和Notch signaling pathway)和细胞间交流相关通路(如Focal adhesion),说明次级毛囊周期循环与皮肤环境中其它类型细胞调控息息相关;4、通过组织表达谱分析,发现LHX2基因在陕北白绒山羊的皮肤、肝脏和大脑中表达较高,且LHX2在皮肤中的表达具有明显的时间特异性,在4月份其表达量显著低于10月份(p<0.01);mi R-144-3p在皮肤中的表达也具有时间特异性,在休止期的表达显著高于生长期(p<0.01)。5、成功分离培养了次级毛乳头细胞,用毛乳头细胞分子标记α-SMA、Versican和CD133进行细胞免疫荧光鉴定,均显示为阳性,将毛乳头细胞传至第8代,发现其仍具有较强的凝聚性,说明在一定代数内毛乳头细胞仍具有一定活性。6、LHX2 3’UTR具有多个mi R-144-3p调控靶位点;mi R-144腺病毒感染毛乳头细胞,可以抑制LHX2的转录后翻译活性,使其蛋白水平降低,同时显著下调BMP2、BMP4和NOG的表达量(p<0.01),并使FGF7、β-Catenin和TGFβ1的表达水平显著上调(p<0.01)。7、成功构建了LHX2-/-细胞株,在该细胞株中,FGF7、FGF10、TGFβ2和TGFβ3的表达量显著上调,且与野生型细胞株相比,其增殖能力较快,表明LHX2-/-缺失可能促使SDP细胞增殖及Mx细胞增殖。8.、对毛乳头细胞进行mi R-144-3p过表达和LHX2基因敲除处理,发现在两种处理情况下,毛乳头表达基因具有一定相似性,FGF7和β-catenin表达上调。综上所述,本研究首次对陕北白绒山羊全年不同月份的次级毛囊长度及其毛球宽度变化进行量化研究,并归纳其次级毛囊周期循环时间节点。通过转录组联合分析筛选出潜在调控次级毛囊周期循环的靶基因,并在毛乳头细胞中验证mi R-144-3p与LHX2协同作用并调控毛囊细胞的增殖,同时为进一步揭示非编码基因调控次级毛囊周期循环的分子机理奠定基础。