论文部分内容阅读
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)引起的奶牛乳腺炎目前尚无有效的商品化疫苗,而有研究发现相比S.aureus纤维连接素结合蛋白 B(fibronectin binding protein B,FnBPB)和凝集因子 A(clumping factor A,ClfA)两种黏附素的重组蛋白FnBPB-ClfA,其IgG Fc段融合重组蛋白Fc-FnBPB-ClfA刺激机体产生了更高水平的全身及乳腺局部体液免疫应答。因此,本研究对S.aureus黏附素重组蛋白与牛Fc融合后是否通过FcRn的参与提高抗原蛋白转运效率进行了研究,随后使用该融合重组蛋白为抗原的亚单位疫苗进行本动物的免疫效果评估,并研发一种比传统方法使用简便、省时省力的、可在奶牛接种疫苗前后进行免疫效果细菌学评价的鉴别显色培养基。1.S.aureus基因工程亚单位疫苗抗原蛋白转运效率的探究:将原代奶牛乳腺上皮细胞(primary bovine mammary epithelial cells,pbMECs)培养于Transwell至形成完整性较好的细胞屏障。此时细胞屏障上方加入重组蛋白及胞吞转运路径抑制剂(或FcRn封闭剂葡萄球菌蛋白A),同时设置37℃、4℃处理组,3 h、6 h后以Western Blot检测细胞屏障下方及亚细胞结构积聚的重组蛋白。结果表明2种重组蛋白均可被pbMECs的FcRn介导的胞吞转运作用转运跨过细胞屏障,FcRn优化了 Fc融合蛋白在pbMECs的胞内转运途径、提高了 S.aureus基因工程亚单位疫苗Fc融合蛋白经pbMECs胞吞转运作用的转运效率。2.鉴别显色培养基的研制与评估:首先,本研究将收集的13个菌属、43个菌种的奶牛乳腺炎病原菌分3组鉴别,并通过IMG、KEGG数据库的代谢通路及PathComp筛选组内保守性、特异性良好而组间差异大的酶及可代谢碳源。其次,根据KOMODO数据库培养基基础成分,连同上述酶的合成的显色底物和碳源配制成鉴别显色培养基,并接种乳腺炎常见病原菌的标准菌株、野生型菌株,评估鉴别显色效果。然后,通过Plackets-Burman试验、响应面法BOX-Behnken Design优化培养基组分。最后,使用传统的生化鉴定、16S rRNA核酸序列测定及研制的鉴别显色培养基对乳腺炎牛奶样品进行病原菌的分离鉴定。结果表明鉴别显色培养基上乳腺炎常见各种属病原菌的菌落颜色、培养基基质颜色明显不同,肉眼即可辨别,与传统方法鉴定结果高度一致。3.S.aureus基因工程亚单位疫苗本动物免疫效果增强的验证:15头健康荷斯坦奶牛随机平均分为三组,其中两组分别用Fc-FnBPB-ClfA、FnBPB-ClfA以乳头管灌注免疫,另外一组用生理盐水同等免疫。灌注免疫6h后挤奶,使重组蛋白只在乳头管内作用6h。免疫14 d后Fc-FnBPB-ClfA免疫组奶牛的血清、乳清中特异性IgG水平与FnBPB-ClfA免疫组相比显著升高(P<0.001),进一步增强了奶牛全身及乳腺局部的体液免疫应答。4.S.aureus基因工程亚单位疫苗免疫效果评估:随机抽取60头奶牛,分为2组,免疫组以Fc-FnBPB-ClfA配合左旋咪唑经首次肌肉注射、二次乳头管灌注免疫,对照组以生理盐水配合佐剂同等免疫。在免疫0d、14 d、28 d、60 d后以间接ELISA检测奶牛血清、乳清中特异性抗体水平、用体细胞计数仪检测牛奶中体细胞数(somatic cell count,SCC)、用鉴别显色培养基检测牛奶中病原菌。结果显示,免疫组奶牛血清、乳清中特异性IgG水平与对照组相比在14 d即显著升高(P<0.001),在28 d分别达到最高效价1:8192、1:1024,牛奶中SCC平均水平未见升高,鉴别显色培养基与传统方法鉴定结果高度一致,真实性、可靠性、实用性较好。综上所述,奶牛乳腺上皮细胞FcRn参与并增强了牛Fc与S.aureus黏附素融合蛋白的胞吞转运作用、提高了抗原蛋白的转运效率,进而刺激奶牛产生更显著的全身及乳腺局部的体液免疫应答。Fc-FnBPB-ClfA配合盐酸左旋咪唑佐剂的乳腺炎S.aureus基因工程亚单位疫苗可刺激奶牛产生稳健的全身及乳腺局部体液免疫应答。作为疫苗免疫效果细菌学评价方法的鉴别显色培养基可用于免疫前后牛奶样品中乳腺炎常见病原菌的分离鉴定,与传统方法相比操作简单、省时省力、判定直观,具有较好的真实性、可靠性、实用性。