论文部分内容阅读
目的:为研究沙门菌毒力基因spvB在沙门菌感染过程中的毒力作用及机制,本研究第一部分通过建立沙门菌感染的巨噬细胞（macrophagy,Mφ）模型,深入探讨spvB对Mφ铁稳态的影响及分子机制,为阐明spvB促进沙门菌胞内生长从而加重感染提供新的思路。第二部分利用CRISPR/Cas9技术构建NLRP3基因敲除人单核THP-1细胞系,为探索NLRP3在炎症过程中对Mφ铁稳态的影响及机制研究提供工具和手段。方法:一、沙门菌毒力基因spvB对细胞铁稳态的影响及分子机制研究1.沙门菌毒力基因spvB对细菌生长的影响将鼠伤寒沙门菌标准毒株SR-11、spvB基因敲除株SR-11-ΔspvB及spvB基因回补株SR-11-c-ΔspvB过夜培养,菌液以1:100的比例接种于100 ml新鲜LB液体培养基中,每隔1 h测定OD600,同时于4 h、8 h和12 h取适量菌液采用梯度倍比稀释法做平板菌落计数（colony forming unit,CFU）。2.沙门菌毒力基因spvB对巨噬细胞内细菌生长的影响以SR-11、SR-11-ΔspvB及SR-11-c-ΔspvB为受试菌,按感染复数（multiplicity of infection,MOI）20:1感染巨噬细胞,建立巨噬细胞感染模型。于不同感染时间点收集细胞,利用平板菌落计数法进行Mφ内活菌计数。为明确spvB促进沙门菌胞内生长是否与胞内铁含量相关,利用PBS、枸橼酸铁铵（ferric ammonium citrate,FAC）和去铁酮（defriprone,DFP）分别预处理Mφ24 h,不同感染时间点收集细胞后进行Mφ内活菌计数。3.沙门菌毒力基因spvB对Mφ胞内铁含量的影响不同感染时间点收集细胞,原子吸收分光光度法检测细胞内铁含量;提取细胞总RNA,实时荧光定qPCR检测Mφ铁输出膜转铁蛋白（ferroportin,Fpn）、铁摄取转铁蛋白受体1（transferrin receptor 1,TfR1）和二价金属转运蛋白1（divalent metal transporter 1,DMT1）等铁调节相关基因的mRNA转录水平;提取细胞总蛋白,Western blotting检测FPN蛋白的表达水平。4.沙门菌毒力基因spvB对NLRP3的影响不同感染时间点收集细胞,提取细胞总RNA,qPCR检测Mφ的NLRP3、IL-1β和IL-18的mRNA转录水平;Western blotting检测NLRP3蛋白表达水平。5.qPCR检测相关炎症因子的变化qPCR检测Mφ脂质运载蛋白2（Lipocalin 2,Lcn2）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、IL-6和IL-10的m RNA转录水平。二、NLRP3基因敲除细胞系的构建根据靶位点的设计原则,筛选4组针对不同NLRP3外显子序列的sgRNA目标序列,以pUC57质粒为模板对sgRNA片段进行有效的PCR扩增,与pGL3质粒载体一起,通过Esp3I单酶切、连接、转化获得重组载体。XhoI酶切和Sanger测序鉴定后选择成功组装的重组pGL3质粒载体与Cas9质粒共转THP-1细胞,用有限稀释法最终挑选出细胞单克隆。利用Western blotting检测上述细胞单克隆NLRP3蛋白的相对表达量。结果:一、沙门菌毒力基因spvB对细胞铁稳态的影响及分子机制研究1.沙门菌毒力基因spvB对细菌生长的影响平板菌落计数结果显示,SR-11、SR-11-ΔspvB和SR-11-c-ΔspvB的生长未见明显差异。2.沙门菌毒力基因spvB对巨噬细胞内细菌生长的影响随感染时间延长,Mφ胞内细菌数量明显增加,但SR-11-ΔspvB感染组胞内CFU均低于SR-11和SR-11-c-ΔspvB感染组,说明spvB可促进沙门菌在Mφ内生长;FAC和DFP预处理感染模型中各感染组间Mφ胞内细菌计数均无明显差异,说明spvB对沙门菌在Mφ内生长的影响与Mφ胞内铁含量相关。3.沙门菌毒力基因spvB对Mφ胞内铁含量的影响qPCR结果显示,SR-11-ΔspvB感染组MφFPN mRNA转录水平均显著高于SR-11和SR-11-c-ΔspvB感染组,但各感染组间TfR1和DMT1 mRNA转录水平未见显著差异,提示spvB通过抑制MφFPN的表达,从而限制胞内铁的外排。4.沙门菌毒力基因spvB对NLRP3的影响qPCR结果表明,在感染后2 h和4 h,SR-11-ΔspvB感染组NLRP3、IL-1β和IL-18 mRNA转录水平均明显低于SR-11和SR-11-c-ΔspvB感染组,且Western blotting检测NLRP3蛋白表达水平结果与qPCR检测结果一致,说明spvB可激活NLRP3炎性小体。5.qPCR检测铁相关炎症因子的变化SR-11和SR-11-c-ΔspvB感染组Lcn2、TNF-α和IL-6转录水平显著高于SR-11-ΔspvB感染组,IL-10转录水平低于SR-11-ΔspvB感染组。二、NLRP3基因敲除细胞系的构建利用CRISPR/Cas9技术构建NLRP3基因敲除人单核THP-1细胞系,Western blotting结果显示成功构建了THP1-defNLRP3细胞系。结论:1.沙门菌毒力基因spvB促使Mφ胞内铁含量增加有利于沙门菌在Mφ内生长。2.沙门菌毒力基因spvB能通过抑制MφFPN的表达,限制胞内铁的外排,导致胞内铁含量增加。3.沙门菌毒力基因spvB可促进NLRP3炎性小体激活并加重炎症反应,此过程与胞内铁含量增加呈正相关。4.利用CRISPR/Cas9技术成功构建NLRP3基因敲除人单核THP-1细胞系,为进一步探索NLRP3在炎症过程中对Mφ铁稳态的影响及机制提供工具和手段。