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黄曲霉毒素（Aflatoxin,AF）可由多种曲霉菌属的真菌产生,主要为黄曲霉菌和寄生曲霉菌。黄曲霉毒素B,（AflatoxinB,,AFB1）,是人类,鸟类,猪,鱼类和啮齿类等许多动物的强力致癌毒物。AFB1的靶器官是肝脏,它能诱导肝脏细胞的DNA、蛋白质及脂质损伤,并导致癌症发生。AFB1本身无毒,但可经过细胞色素P450（cytochrome P 450,CYP450）代谢生成有毒的中间产物（exo-AFB1-8,9-epoxide,exo-AFBO）,从而产生毒性,AFB,引起的氧化应激是其毒性作用的重要途径之一。目前已报道多种化合物可抵抗AFB,的氧化应激反应如维生素A、C和E以及丁香酚等。硒和山豆根多糖（Bush Sophora Root polysaccharides,BSRPS）分别作为动物体必需营养和中国传统中药成分,二者的抗氧化能力亦较为突出。目前,本实验室通过体外培养技术优化分离得到了鸡原代肝细胞,并于体外环境下验证了硒的抗氧化作用可缓减AFB1的肝毒性,而关于硒在体内环境下对AFB,的肝毒性是否有抵抗作用还不得而知,因此本研究就不同硒源在体内环境下对AFB,的致鸡肝毒性是否有缓减作用及其机制进行了探究;而山豆根多糖对黄曲霉毒素B,氧化应激损伤的影响研究尚未见报道。因此,本课题以此为切入点,拟探讨山豆根多糖和硒对黄曲霉毒素B,的肝毒性作用的缓减机制,主要内容如下:试验一.黄曲霉毒素B1对鸡原代肝细胞的损伤鸡原代肝细胞是由本实验室所优化的胶原酶灌流消化法而分离得到的,经过台盼蓝染色测得每个肝脏经消化分离获得的细胞的存活率为94%±0.6%（n=3）;每消化一个肝脏组织可获得的活细胞总数为（10.7±0.4）×108个（n=3）。用DMEM培养液将细胞稀释到5×105个/mL的浓度,以200 μL/孔和3 mL/孔的细胞量分别接种于96孔板和6孔板,并在37℃、5%CO2培养箱中培养,通过MTT法检测肝细胞活性的OD值和细胞培养液中LDH、ALT和AST等酶的活力,用于测定AFB1损伤细胞的最低致毒浓度。结果发现:肝细胞的活力OD值随着毒素浓度的增加而降低,细胞培养液中LDH、ALT和AST等酶活力随着毒素浓度的增加而升高;而当AFB1的浓度为0.05μg/mL时,这几个指标虽较空白组高但差异不显著。这表明AFB,对鸡原代肝细胞有损伤作用,且最低致毒浓度为0.05 μg/mL。试验二.山豆根多糖缓减黄曲霉毒素B1对鸡原代肝细胞的毒性作用山豆根多糖是根据已有文献方法提取的,测定其含量后用PBS稀释到5 mg/mL的浓度备用。以200 μL/孔和3 mL/孔的细胞量,将5×10°个/mL的鸡原代肝细胞分别接种于96孔板和6孔板,并在37℃、5%C02培养箱中培养,分别用于测定山豆根多糖的安全浓度及其对AFB1作用下的鸡原代肝细胞的影响。通过检测肝细胞的MTT和细胞培养液中LDH、ALT和AST等酶的活力,结果发现:1600 μg/mL的山豆根多糖能引起细胞损伤,而100、200、400和800 μg/mL的山豆根多糖浓度是安全的,且山豆根多糖对AFB,作用下的鸡原代肝细胞的有效保护浓度为200、400 和 800μg/mL。试验三.山豆根多糖缓减黄曲霉毒素B1肝脏毒性的作用机制山豆根多糖的有效保护浓度确定后,以3 mL/孔的细胞量将5×105个/mL的鸡原代肝细胞接种于6孔板,并在37℃、5%CO2培养箱中培养,测定肝细胞的抗氧化能力、CYP450 1A5、3A37和SOD2的mRNA水平。结果显示:与空白组相比,AFB1能显著降低鸡原代肝细胞内SOD2与GSH-Px的活性和SOD2的mRNA水平,而显著升高MDA的量和CYP450 1A5的mRNA水平,这说明AFB1能降低鸡原代肝细胞的抗氧化能力;而与AFB,组相比,加入山豆根多糖能显著逆转AFB1对鸡原代肝细胞的抗氧化能力的影响,且对SOD2的逆转效果更显著。为了探究山豆根多糖缓减AFB1对肝细胞的氧化损伤的机制及其与肝细胞内SOD2之间的关系。通过干扰肝细胞中的SOD2基因,检测肝细胞中CYP450 1A5 mRNA水平,并比对干扰前后肝细胞的活性和释放于细胞外的LDH、ALT和AST的酶活力。结果显示:SOD2被干扰后,在BSRPS + AFB1作用下的肝细胞CYP45O1A5mRNA水平升高,细胞活性降低,而细胞外液LDH、ALT和AST酶活力增加。这说明SOD2被干扰后,AFB1对肝细胞的氧化损伤加重,而山豆根多糖可能主要是通过提高SOD2的活性从而降低CYP450 1A5的水平来缓解AFB1对肝细胞的氧化损伤。试验四.不同硒源缓减黄曲霉毒素B1肝脏毒性的作用机制为了探讨不同硒源对黄曲霉毒素B,（AFB,）致鸡肝毒性的影响。选用1日龄健康ROSS 308肉仔鸡120羽,随机分为4组:空白组、100 μg/kg AFB,组、Na2Se03+AFB1（100 μg/kg）组和 SeMet+ AFB1（100 μg/kg）组,试验为期 42 d。结果表明:1)AFB,能显著降低肉仔鸡的肝重、血清中总蛋白（TP）、肝组织中还原型谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）及总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性,显著升高血清中天门冬氨酸氨基转移酶（AST）与丙氨酸氨基转移酶（ALT）的活力和肝组织中脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的量;2)加硒可以显著缓解AFB,引起的鸡肝重、血清TP量和肝组织中GSH量以及肝GPx和T-SOD酶活性的下降,能够显著降低AFB,引起的血清AST和ALT酶活力的升高以及肝组织中MDA量的增加,且有机硒的缓解作用略优于无机硒;3)AFB1能显著增加AF代谢的关键酶CYP4501A5的mRNA及其蛋白表达水平,而加硒可以显著抑制CYP450 1A5的表达,且有机硒略优于无机硒对CYP450 1A5表达的抑制作用。这些结果表明:硒特别是有机硒,能有效减轻或基本消除AFB1对肉仔鸡肝脏的损害作用。