羟基自由基（·OH）具有高度的反应活性，到目前为止还无法被直接检测到，而间接检测羟自由基的方法又都缺乏生物相关性。在清除羟自由基的分析方法中，应用得最广的经典方法是脱氧核糖降解法，但这种方法不仅缺乏生物相关性，更缺乏专属性和可靠性。因此，建立起一种具有生物相关性、科学可靠、简单易行的清除羟自由基分析方法是十分必要的。　　目的：　　建立一种以 DNA氧化损伤为基础、具有生物相关性的、可靠易行的清除羟自由基分析方法。　　方法：　　预实验表明脱氧核糖作为底物不具有专属性和生物相关性。选择 TBARS(硫代巴比妥酸反应物)作为被羟基攻击的底物的生物标记。将6种底物脱氧核糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、胞嘧啶、DNA采用原始的脱氧核糖降解法实验后的反应产物进行紫外吸收全波长扫描和高效液相色谱分析，根据结果确定最佳检测波长和选择一种具有直接生物相关性的、合理科学的物质作为新的底物。　　确定新底物的选择后，以脱氧核糖降解法为基础，依次探究整个反应体系的各种反应因素后初步确定新方法的最佳反应条件。　　预实验观察到反应存在严重的溶剂干扰效应（即溶剂可清除·OH），因此对溶剂效应进行研究。分别选择14种常用的有机纯溶剂、5种抗氧化对照品（乙醇溶液）和抗氧化对照品（残渣）进行阳性、阴性对照实验，确定实验应挥干溶剂再进行以排除溶剂的干扰，进而最终确定新方法的反应条件。　　将30种包括所有化合物类型的抗氧化剂应用在新方法中，综合评价抗氧化剂清除·OH的效果（R值和RSD%值），同时进行方法学考察（线性关系、准确性、重复性），进一步验证新方法应用的广泛性和科学可靠性。　　结果：　　包括脱氧核糖在内的6种底物采用脱氧核糖降解法实验所得的反应产物紫外吸收全波长扫描图谱基本一致，均在254 nm和530 nm左右有最大吸收波长，这说明原始的脱氧核糖降解法不具有专属性，应选择一种具有直接生物相关性的物质作为新的底物。在原始的脱氧核糖降解方法中，脱氧核糖被选择作为羟自由基攻击的物质是因为其为构成DNA骨架的一部分，因此，直接用DNA本身代替脱氧核糖进行实验是更加合理科学的；同时考虑到DNA在生物医学上所起的至关重要的作用，因此首先考虑将DNA作为新的底物；高效液相色谱分析则表明，DNA在254 nm处比脱氧核糖有更多吸收峰，这些吸收峰为氧化损伤片段，但这些片段在530 nm处并无吸收，因此，新方法选择DNA为底物，530 nm作为检测波长。　　以脱氧核糖降解法为基础，依次探究整个反应体系的各种反应因素后初步确定新方法的最佳反应条件。　　实验表明，如果用溶剂进行样品溶液的准备会带来强烈的干扰效应。为了进一步阐明溶剂干扰效应的机理，我们测定了14种有机纯溶剂的羟自由基清除活性。结果表明所有的这些有机溶剂均对羟自由基有不同程度的清除作用。特别要说明的是，4μL的乙醇就可以清除体系中80%的羟自由基。因此，这种强烈的溶剂干扰效应来源于有机溶剂自身产生的羟自由基清除作用，这归因于羟自由基的高度反应活性。基于此事实，我们认定任何有机溶剂都应在反应前挥干，否则结果就会非常不准确。挥干的温度最好低于60℃以防抗氧化样品被破坏。　　综合探究反应体系的各个影响因素和溶剂干扰效应后，确定新方法的最佳条件和操作步骤，具体如下：选择合适的有机溶剂溶解样品后，将样品溶液按不同加样体积加入试管中。60℃水浴挥干溶剂后，依次加入400μL磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH7.40）、100μL DNA溶液（10 mg/mL）、Na2EDTA（0.5 mmol/L）、75μLH2O2（33.6 mmol/L）、50μL FeCl3（3.2 mmol/L）、75μL抗坏血酸（12 mmol/L），摇匀后于55℃水浴孵化20分钟，再依次加入250μL三氯乙酸（TCA，0.6 mol/L）和150μL2-硫代巴比妥酸（TBA，0.35 mol/L，含0.3 mol/L的NaOH），105℃烘箱加热15分钟进行显色，冷却后于530 nm处测定吸光度（缓冲液作为空白溶液）。羟基清除率的计算：清除率%=（A0-A）/A0×100%，其中，A0为不含样品的阴性反应混合液于530 nm处的吸光度，A为样品反应混合液于530 nm处的吸光度。　　将30种不同化合物类型的抗氧化剂采用新方法进行清除羟基的活性测定，所得的剂量依赖曲线和数据分析显示出较高的R值（R=0.8874-0.9940；平均值0.9542）和较低的RSD值（RSD=0.95%-9.88%，平均值5.63%），这说明新方法具有良好的线性、准确性和应用广泛性；重复性实验结果（DNA损伤法日间-相对偏差 RSD%为2.83%，脱氧核糖降解法日间-相对偏差RSD%为2.94%）则表明新方法具有更好的重复性(p<0.05)。　　结论：　　相比较清除羟基的经典方法脱氧核糖降解法，本研究建立的DNA损伤方法充分考虑了生物相关性、专属性、可靠性，并消除了原方法所存在的严重的溶剂干扰效应，这个方法仅需要一台紫外分光光度检测器和一些廉价的生物化学试剂，因此，新建立的以DNA损伤为基础的羟自由基清除分析方法是一个生物相关的、可靠、专属、简单、适用于所有抗氧化剂的体外清除羟基自由基分析方法。