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目的:间充质干细胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)是一类具有多向分化和靶向肿瘤细胞潜能的成体干细胞,并能够在体内外分泌细胞因子,调节肿瘤细胞的凋亡、周期和转移等相关信号通路,进而能够对肿瘤起到抑制作用。目前,体外MSCs的研究多在二维培养条件下完成。二维细胞培养技术培养的细胞在体外环境下逐渐丧失了其体内原有的性状,在形态、结构和功能方面都与其在体内自然生长的状态有一定的差距;而动物实验具有多种不可控因素,探究具体机制方面存在诸多困难。三维细胞培养技术是在二维细胞培养和动物实验模型的基础上发展起来的简单、有效的细胞培养方式,利用三维细胞培养技术可以更好的模拟体内微环境,从而能够更好的研究MSCs对肿瘤的抑制作用。鉴于此,本论文旨在建立人骨髓MSCs的高效三维培养体系,并研究其在三维与二维体系中的活性、增殖和细胞因子分泌情况,在此基础上进一步探讨MSCs在三维和二维培养条件下对肝癌细胞的抑制作用和机制,为三维培养的MSCs应用于肿瘤治疗提供实验依据,拓展了干细胞的应用前景。方法:首先,采用天然高分子材料胶原和Matrigel为支架建立三维培养体系培养MSCs,利用AO/PI染色法、CCK-8法和透射电镜分析研究了三维体系培养的MSCs与二维单层培养体系培养的MSCs在活力、增殖和因子分泌方面的不同。其次,利用条件培养基(conditioned medium,CM)实验研究了三维培养的MSCs通过分泌细胞因子对肝癌细胞HePG2产生的体外抑制作用。同时,进行裸鼠体内异位瘤实验,裸鼠皮下分别注射经过三维和二维培养的MSCs的CM处理过的HepG2细胞,观察肿瘤形成起始时间,测量肿瘤体积,并进行冰冻切片和苏木精-伊红组织切片染色(hematoxylin-eosin stain-ing,H&E),探讨了 MSCs在体内对肝癌细胞HepG2的抑制作用。然后对三维和二维培养的MSCs进行基因表达芯片的检测,探究不同的培养体系对MSCs基因表达的影响。在此基础上结合查阅文献结果,筛选出三维培养的MSC表达上调最明显的抑癌因子IL-24作为候选因子,来进一步探究其在MSCs抑制HepG2增殖过程中的作用。接着利用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)和酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)验证三维培养的MSCs表达和分泌IL-24因子的情况。随后,RT-PCR检测HepG2细胞中IL-24因子的受体IL-20R1、IL-20R2和IL-22R1的表达。最后,Western Blot检测了三维和二维培养体系培养的MSCs CM处理过的HepG2细胞中JAK-STAT信号通路相关蛋白的表达,探究MSCs对HepG2细胞的抑制机制。结果:AO/PI染色法实验结果证明,三维和二维体系培养的MSCs活率均较好,而且三维体系培养的MSCs活率比二维体系培养组更好,细胞成叠层生长,活细胞数量更多。CCK-8实验结果表明,接种相同数量的MSCs在三维和二维培养体系中培养,从第4d开始,两组的增殖情况表现出极显著的差异(***p<0.001)。培养后的第11d,三维培养的MSCs的OD值是二维培养组的3倍。由此可见,三维培养的MSCs具有更好的增殖能力。透射电镜观察结果表明,三维培养的MSCs相比于二维培养组含有更少的微绒毛和更多的粗面内质网,说明细胞在胶原/Matrigel支架材料中生长良好,更接近体内的生长状态,合成蛋白质的能力更强。随后的CM实验结果证明,三维和二维培养的MSCs可以通过分泌细胞因子对HepG2细胞产生抑制作用,且三维培养组抑制作用更强。实验结果也证明了,三维和二维培养的MSCs的抑制效应存在剂量依赖性和时间依赖性,即随着MSCs CM浓度的增加和处理时间的延长,抑制率增加。体内实验证明,三维和二维培养的MSCs均能延迟肿瘤的起始时间,分别延迟了 12d和8d;而且肿瘤的大小也被抑制,结果显示,三维处理组肿瘤体积最小,二维处理组次之,对照组肿瘤体积最大,而且三个组肿瘤体积大小差异极显著(***p<0.001)。肿瘤组织的H&E染色结果证明,未处理的HepG2对照组中可以看见丰富密集的肿瘤细胞,且瘤细胞较大,染色较深,二维培养的MSCs CM处理组中肿瘤细胞分布较少,结缔组织较多,三维培养的MSCs CM处理组中肿瘤细胞分布最少,结缔组织最多。Affymetrix GeneChip(?)Prime ViewrM Human Gene Expression Array 检测结果发现,三维和二维培养的MSCs表达差异最明显的是IL-24因子,随后通过RT-PCR、Real-time PCR和ELISA实验进一步验证了这一结果,证明了三维培养的MSCs较二维培养组和对照组表达和分泌更多的IL-24因子。HepG2细胞的RT-PCR结果显示,HepG2细胞中IL-24因子的受体IL-22R1和IL-20R2表达量较高,而IL-20R1几乎不表达,由此推测IL24因子可能通过IL-22R1/IL-20R2异源二聚体将信号传递到HepG2细胞中。Western Blot实验结果证明,三维培养的MSCs CM处理组中磷酸化的JAK1和STAT3较其它组表达上调,且这两种磷酸化蛋白的表达量和其它组相比差异极显著(***p<0.001)。结论:本研究建立了胶原/Matrigel三维支架材料构成的MSCs三维培养体系,证明了,该三维体系培养的MSCs在细胞活力、细胞增殖、基因表达等方面都具有很好的效果。体内外实验证明了三维体系培养的MSCs比二维体系培养的MSCs对肝癌细胞有更强的抑制作用,并进一步探讨了其抑制作用增强的机制。三维培养的MSCs能够表达和分泌更多的IL-24因子,IL-24能与HepG2细胞表面受体IL-22R1/IL-20R2异源二聚体结合,并激活下游JAK1-STAT3信号通路,从而抑制了 HepG2细胞的增殖,在三维培养的MSCs对HepG2细胞的抑制效应中发挥了重要作用。本实验突破了传统的对二维单层培养的MSCs肿瘤抑制作用的研究,从而更加贴近体内微环境,得到与体内更接近、更有参考价值的结果,为三维培养的MSCs应用于肿瘤的治疗提供了更精准的实验依据,拓展了干细胞的应用前景。