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前言世界范围内,膀胱癌发病率居恶性肿瘤的第九位,在我国,膀胱癌发病率居恶性肿瘤的第十位,近年来膀胱癌发病率及死亡率有增高的趋势。大量流行病学研究发现吸烟和接触化学致癌物是膀胱癌的主要致病因素。其它可能的致病因素还包括人造甜味剂、咖啡、染发剂、长期饮用砷含量高的饮用水等。然而接触同样的环境危险因素,却只有小部分人发生膀胱癌,这提示不同的个体对膀胱癌有遗传易感性。体内与肿瘤相关基因DNA序列的改变赋予个体不同的遗传背景,引起个体或群体对恶性肿瘤易感性的差异,近年来,随着对肿瘤遗传易感性研究的增加,肿瘤相关基因多态性的研究越来越被学者重视。流行病学研究发现低叶酸摄入水平会增加肿瘤的发病风险,这主要是因为低叶酸摄入会导致DNA合成障碍和DNA甲基化状态紊乱。叶酸在体内的代谢过程即是一碳单位的转运过程,一方面,叶酸以5-甲基四氢叶酸(5-THF)的形式合成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)以提供甲基基团用于DNA甲基化,SAM是体内通用甲基供体；另一方面,叶酸以5,10-亚甲基四氢叶酸(5,10-methylenetetrahydrolate)的形式参与DNA的合成过程。叶酸这两个代谢过程对于机体极其重要,若此代谢过程出现异常并长期存在,则很有可能导致癌变。叶酸代谢酶基因存在众多的单核苷酸多态,这些基因单核苷酸多态可通过改变酶活性进而影响叶酸在体内的合成和代谢。因此我们假设叶酸代谢酶基因MTHFR和MTR多态位点的存在可能会影响叶酸的合成和代谢,进而可导致DNA的合成障碍和DNA的甲基化状态紊乱。DNA甲基化状态紊乱包括全基因组低甲基化或特异性基因高甲基化,而全基因组低甲基化又常常伴有肿瘤抑癌基因的高甲基化,这都有可能导致膀胱癌的发生。本课题探讨叶酸代谢酶基因MTHFR和MTR多态性与膀胱癌遗传易感性的关系,同时初步探讨抑癌基因RASSF1A基因启动子区甲基化状态与叶酸代谢酶基因MTHFR多态性之间的关系。材料和方法本课题采用以医院为基础的病例对照研究设计,研究对象为东北地区的汉族居民,病例组膀胱癌患者312例,对照组325例。病例组是在中国医科大学附属盛京医院泌尿外科收治的原发性膀胱癌患者,均经病理确诊,既往无肿瘤史,术前未经放疗及化疗。对照组为同期收治的其他非肿瘤患者及健康体检者。病例组与对照组在年龄(土5岁)及性别相匹配。采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism, PCR-RFLP)技术,检测MTHFR (C677T, A1298C)及MTR (A2756G)基因位点的多态性。采用甲基化特异性PCR((Methylation specific PCR, MSP)方法,在病例组中随机选取45例膀胱癌组织,检测RASSF1A基因启动子区甲基化情况。结果一、MTHFR (C677T, A1298C)与膀胱癌遗传易感性1、病例组中MTHFR C677T的三种基因型CC、CT及TT的频率分别为26.28%、54.17%和19.55%,对照组分别为34.77%、52.31%和12.92%,两组间比较有统计学差异(P=0.017)；病例组与对照组MTHFR C677T的T等位基因频率分别为46.64%和39.08%,有统计学差异(P=0.006)。病例组中MTHFR A1298C的三种基因型AA、AC及CC的频率分别为68.91%、29.17%和1.92%,对照组分别为69.54%、28.31%和2.15%,两组间比较无统计学差异(P=0.955)；病例组与对照组MTHFR A1298C的C等位基因频率分别为16.51%和16.31%,无统计学差异(P=0.924)。2、携带MTHFR 677TT基因型的个体发生膀胱癌的风险是携带677CC基因型者2.00倍(95%CI：1.23-3.25),MTHFR A1298C基因多态与膀胱癌遗传易感性无显著关联。3、MTHFR C677T与MTHFR A1298C联合分析,病例组与对照组中同时携带MTHFR TT/AA (677TT+1298AA)基因型的频率分别为19.55%和12.92%,两组间比较有统计学差异(P=0.003)。4、携带MTHFR TT/AA (677TT+1298AA)基因型者发生膀胱癌的风险是携带CC/AA(677CC+1298AA)基因型者2.27倍(95% CI：1.33-3.90)。5、以携带MTHFR 677CC基因型不吸烟的个体为参照,在既往吸烟者中,携带MTHFR 677CC基因型的个体和携带MTHFR 677CT或TT基因型的个体发生膀胱癌的风险分别增加到2.89倍(95% CI：1.41-5.95)和3.81倍(95% CI：2.09-6.93),而在现时吸烟者中,风险分别增加到5.02倍(95% CI：2.39-10.54)和7.36倍(95% CI：3.88-14.15)。6、当以携带MTHFR 1298AA基因型不吸烟的个体为参照,在既往吸烟者中,携带MTHFR 1298AA基因型的个体和携带MTHFR1298AC或CC基因型的个体发生膀胱癌的风险分别增加到1.60倍(95% CI：1.02-2.51)和2.89倍(95% CI：1.60-5.21),而在现时吸烟者中,风险分别增加到3.15倍(95% CI：1.96-5.09)和5.27倍(95% CI：2.34-11.85)。7、以携带MTHFR 677CC基因型吸烟量为0包年的个体为参照,吸烟量<35包年的个体,携带MTHFR 677CC基因型者和携带MTHFR 677CT或TT基因型者发生膀胱癌的风险分别增加到2.44倍(95% CI：1.19-5.02)和4.47倍(95% CI：2.50-8.00),而在吸烟量≥35包年的个体中,风险分别增加到6.20倍(95% CI：2.91-13.23)和6.79倍(95% CI：3.30-13.97)。8、当以携带MTHFR 1298AA基因型吸烟量为0包年的个体为参照,吸烟量<35包年的个体,携带MTHFR 1298AA基因型的个体和携带MTHFR1298AC或CC基因型的个体发生膀胱癌的风险分别增加到1.88倍(95% CI：1.24-2.86)和3.13倍(95% CI：1.68-5.85),而在吸烟量≥35包年的个体中,风险分别增加到3.25倍(95% CI：1.85-5.72)和4.17倍(95% CI：2.04-8.51)。二、MTR A2756G基因多态与膀胱癌遗传易感性1、病例组中MTR A2756G的三种基因型AA、AG及GG的频率分别为83.97%、13.14%和2.88%,对照组分别为86.46%、12.31%和1.23%,两组间比较有无统计学差异(P=0.311)；病例组与对照组MTR A2756G的G等位基因频率分别为9.46%和7.38%,两组间比较无统计学差异(P=0.183)。2、MTR A2756G基因多态与膀胱癌遗传易感性无显著关联。3、当以携带MTR 2756AA基因型不吸烟的个体为参照,在既往吸烟者中,携带MTR 2756AA基因型的个体和携带MTR2756AG或GG基因型的个体发生膀胱癌的风险分别增加到2.09倍(95% CI：1.40-3.13)和2.75倍(95% CI：1.32-5.73),而在现时吸烟者中,风险分别增加到3.98倍(95% CI：2.55-6.22)和4.09倍(95% CI：1.69-9.89)。4、当以携带MTR 2756AA基因型吸烟量为0包年的个体为参照,吸烟量<35包年的个体,携带MTR 2756AA基因型的个体和携带MTR2756AG或GG基因型的个体发生膀胱癌的风险分别增加到2.36倍(95% CI：1.61-3.47)和2.60倍(95% CI：1.32-5.15),而在吸烟量≥35包年的个体中,风险分别增加到3.85倍(95% CI：2.35-6.30)和5.39倍(95% CI：1.87-15.50)。三、RASSF1A基因启动子区甲基化状态与MTHFR (C677T, A1298C)基因多态性1、45例膀胱移形细胞癌组织中28例检测到RASSF1A甲基化,8例正常膀胱组织中均未检测到RASSF1A甲基化,两组间甲基化率存在统计学学差异(P=0.001)。2、MTHFR (C677T,A1298C)基因多态与RASSF1A启动子区高甲基化无明显关联。结论1、与MTHFR 677CC基因型相比,携带MTHFR 677TT基因型的个体膀胱癌发病风险增加。MTHFR A1298C和MTRA2756G基因多态与膀胱癌发病风险无明显关联。2、MTHFR C677T与MTHFR A1298C联合分析：与MTHFR CC/AA (677CC+1298AA)基因型相比,携带MTHFR TT/AA (677TT+1298AA)基因型者发生膀胱癌的风险增加。3、MTHFR (C677T, A1298C)和MTR A2756G基因多态与吸烟联合作用研究发现,现时吸烟者和大量吸烟者(≥35包年)无论携带任何基因型,都会增加膀胱癌发病风险；同时,我们发现,现时吸烟者和大量吸烟者(≥35包年)如携带不利的基因型(如MTHFR 677TT),发生膀胱癌的风险将明显增加,提示吸烟与叶酸代谢酶基因多态性存在联合作用。4、膀胱癌组织RASSF1A基因启动子区甲基化率明显高于正常膀胱组织。5、MTHFR (C677T, A1298C)基因多态与膀胱癌组织RASSF1A基因启动子区高甲基化无明显关联。