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植物寄生线虫病给农业、林业造成极其严重的危害。目前,对植物、微生物的杀线虫代谢产物已经有深入研究,报道了很多种杀线虫毒素,但生物的挥发性杀线虫物质研究方面尚未见报道。本文对不同种属细菌的挥发性杀线虫活性进行了评估和鉴定,对挥发物杀线虫细菌进行了分子系统学分析,并分析了营养物质对细菌挥发物杀线虫活性的影响,获得以下主要研究结果:
1、通过分格培养皿法测定了360株细菌的挥发性代谢产物对腐生线虫P.redivivus和松材线虫B.xylophilus 的杀线虫活性,有273(75.3%)株细菌对腐生线虫P.redivivus显示活性(NA≥20%),其中93(25.3%)株细菌对P.redivivus显示强杀线虫活性(NA≥80%)。在这360株供试细菌中,270(75.0%)株对松材线虫B.xylophilus显示活性(NA≥20%),其中有34(9.4%)株细菌对B.xylophilus显示强杀线虫活性((NA≥80%)。在这360株细菌中,26(7.2%)株细菌对两种线虫(P.redivivus和B.xylophilus)都显示强杀线虫活性(NA≥8096),其中包括14(3.9%)株对两种线虫都显示了100%的活性。
2、使用SPME-GC/MS方法研究了细菌挥发性杀线虫物质,对15株具强杀线虫活性细菌和2株无活性细菌进行了杀线虫挥发性成分的鉴定,并用纯品验证最终确定出9种具杀线虫活性的细菌挥发物,并测定了这9种物质的最低杀线虫浓度:十一酮(0.05 mmol),辛醇(0.06 mmol),葵醛(0.20 mmol),苯甲醛(0.39 mmol),壬酮(0.40 mmol),二甲基二硫醚(0.44 mmol),苯乙醛(0.85 mmol),环己烯(0.99 mmol)和苯酚(1.71 mmol)。另外,松油醇和苯乙酮分别对P.redivivus显示了100%和90.36%的活性,苯乙醇和苯乙酮分别对B.xylophilus表现出84.62%和100%的活性。
3、通过RFLP-16S rRNA 分析技术对101株挥发物强活性杀线虫细菌进行分子系统学研究,得到27种RFLP谱带类型,从每种带型中至少挑选一株进行测序,经过Blast和系统发育分析,对P.redivivus有强活性菌株的序列分属以下9大细菌类群:a、芽孢杆菌目(Bacillales),b、放线菌目(Actinobacterales),c、假单胞菌目(Pseudomonadales),d、气单胞菌目(Aeromonadales),e、肠杆菌目(Enterobacteriales),f、黄色单胞菌目(Xanthomonadales),g、黄杆菌目(Flavobacteriales),h、柄杆菌目(Caulobacterales),i、异常球菌目(DeinDcoccales)。对B.xylophilus有强活性菌株的序列属于7大细菌类群:a、芽孢杆菌目(Bacillales),b、放线菌目(Actinobacterales),c、假单胞菌目(Pseudomonadales),d、黄色单胞菌目(Xanthomonadales),e、肠杆菌目(Enterobacteriales), f、柄杆菌目(Caulobacterales)和g、异常球菌目(Deinococcales)。
4、通过分格培养皿法对3株同时对两种线虫(P.redivivus和B.xylophilus)都具有100%杀线虫活性的细菌进行了培养条件的优化,筛选出最佳碳源、氮源和碳氮比。对菌株 Bacillus weihenstephanensis No.1的最佳碳源、氮源和碳氮比分别是麦芽糖、L-酪氨酸和碳:氮=40:1;其余两个菌株细菌(B.simplexNo.2和B.weihenstephanensisNo.3)的最佳碳源、氮源和碳氮比分别是木糖醇、牛肉膏、碳:氮=5:1和柠檬酸、牛肉膏、碳:氮=20:1。